18 контакт: 1-1734742-8, FFC / FPC разъем, 0.5 мм, 18 контакт(-ов), Гнездо, FPC Series, Поверхностный Монтаж

Содержание

Дополнительный контакт CAL-18-11 боковой 1HO+1НЗ для контакторов А(F)95- АF2650, ABB, 1SFN010720R1011

Артикул:

1SFN010720R1011

Производитель:

EAN код:

7320500256305

Код заказа:

COS1SFN010720R1011

Технические характеристики товара:

Дополнительный контакт CAL-18-11 боковой 1HO+1НЗ для контакторов А(F)95- АF2650

Для контакторов серии:

Единицы измерения:

шт

По вопросам актуальных цен, наличия и сроков поставки просьба обращаться к менеджерам.

Аналоги «1SFN010720R1011»

Артикул:

1SBN010020R1011

Производитель:

ABB

2057 руб/шт

Артикул:

1SBN010010R1001

Производитель:

ABB

773 руб/шт

Артикул:

1SBN010010R1010

Производитель:

ABB

773 руб/шт

Популярные товары раздела «Аксессуары для контакторов»

Артикул:

1SBN010110R1010

Производитель:

ABB

692 руб/шт

Артикул:

1SBN010110R1001

Производитель:

ABB

692 руб/шт

Артикул:

1SBN010120R1011

Производитель:

ABB

1860 руб/шт

Артикул:

1SFN010820R1011

Производитель:

ABB

2216 руб/шт

Контакты: 141071 Королёв, МО, ул. Грабина, д.18 Телефоны: (495) 516-88-36

Юридический адрес:141071, Королёв, Московская область, ул. Грабина, д.18, пом.1

Почтовый адрес:      141070, Королёв, Московская область, ул. Циолковского, д.2а

Электронная почта: [email protected]

 

По вопросам, связанным со снабжением электрической энергией (мощностью), Вы можете обратиться:

1. в контактный центр АО «СКЛ» по телефону +7 (499) 550-9-550;

2. в клиентский офис АО «СКЛ», расположенный по адресу Московская область, г. Королёв, ул. Циолковского, д.2а;

3. посредством письма на электронную почту [email protected]

 

График приема для населения:

Понедельник — четверг с 8.00 до 17.00, пятница — до 16.00, обед с 12.00 до 13.00.

Последний рабочий день месяца- неприёмный день.

 

Технический отдел

по будням с 8.00 до 17.00, в пятницу до 16.00, обед с 12.00 до 13.00

Договорной отдел

по будням с 8.00 до 17.00, в пятницу до 16.00, обед с 12.00 до 13.00;

прием документов и заключение договоров осуществляется по будням с 8:00 до 17:00 (в пятницу до 16:00), обед с 12.00 до 13.00.

 

Расчеты с юридическими лицами:

по будням с 8.00 до 17.00, в пятницу до 16.00, обед с 12.00 до 13.00

 

Телефоны:

Телефонное обслуживание физических лиц:

— консультации по вопросам энергоснабжения (режим работы операторов – ежедневно с 8:30 до 20:30, с 20:30 до 8:30 доступна система голосового самообслуживания):

+7 (499) 550-9-550

 

— передача показаний приборов учёта электроэнергии (ежемесячно с 15-го по 26-е число круглосуточно в автоматическом режиме):

+7 (499) 550-9-550

 

Телефонное обслуживание юридических лиц:

+7 (499) 550-9-550

(для соединения с куратором необходимо ввести добавочный номер, указанный в договоре энергоснабжения)

 

Схема проезда

Контакты

Мы в социальных сетях:

Наименование: Государственное автономное учреждение здравоохранения «Городская поликлиника №18»

Адрес: 420087, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Карбышева, д. 72

Телефон регистратуры: 8 (843) 528-07-07

Платные услуги: 8 (843) 224-45-29

Травматологическое отделение: 8 (843) 224-45-19

E-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Режим работы:

Понедельник — пятница 8:00 — 20:00  
Суббота 8:00 — 18:00 (прием ведет дежурный врач)
Воскресенье 9:00 — 15:00 (прием ведет дежурный врач)
Праздничные дни 8:00 — 17:00 (прием ведет дежурный врач)

Филиал на ул. Дубравная


Адрес: 420138, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Дубравная, д. 35

Телефон регистратуры: 8 (843) 269-34-47

Режим работы:

Понедельник — пятница 8:00 — 20:00  
Суббота 8:00 — 18:00
(прием ведет дежурный врач)
Воскресенье 9:00 — 15:00 (прием ведет дежурный врач)
Праздничные дни 8:00 — 17:00 (прием ведет дежурный врач)

Филиал на ул. Зорге


Адрес: 420104, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Зорге, д. 24

Телефон для консультации: 8 (843) 224-32-69

Телефон для записи: 8 (843) 528-07-07

Режим работы:

Понедельник — пятница 8:00 — 20:00  
Суббота 8:00 — 18:00 (прием ведет дежурный врач по адресу: ул. Карбышева, д. 72)
Воскресенье 9:00 — 15:00 (прием ведет дежурный врач по адресу: ул. Карбышева, д. 72)
Праздничные дни 8:00 — 17:00 (прием ведет дежурный врач по адресу: ул. Карбышева, д. 72)

Женская консультация


Адрес: 420101, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Мавлютова, д. 17а

Телефон регистратуры: 8 (843) 224-32-52

Режим работы:

Понедельник — пятница 8:00 — 20:00  
Суббота 8:00 — 18:00 (прием ведет дежурный врач)

Контакты

Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения
«Стоматологическая поликлиника №18»

Санкт-Петербург, Колпино, ул.Веры Слуцкой, д.9
Телефон регистратуры (812) 461-60-42

Обычная версия

 

________________________________________

 

 СПб ГБУЗ «Стоматологическая поликлиника №18»

 196653, Санкт-Петербург, Колпино, ул. Веры Слуцкой д.9, лит.А

Взрослое и детское отделение:
Санкт-Петербург, Колпино, ул.Веры Слуцкой дом 9.
Режим работы:
С 8-00 до 21-00 с понедельника по пятницу.

Технический перерыв с 14-00 до 15-00

Выходные и празничные дни взрослое отделение с 9-00 до 15-00

Воскресенье и праздничные дни детское отделение с 9-00 до 16-00
Суббота детское отделение с 9-00 до 15-00

Зубопротезное отделение:
Санкт-Петербург, Колпино, ул.Тверская д.48, корп.2
Режим работы:
С 8-00 до 21-00 с понедельника по пятницу.
Суббота, воскресенье — выходные дни.

 

 

РЕГИСТРАТУРА

 

Взрослое отделение (812)461-60-42
Детское отделение (812)461-12-17
Зубопротезного отд. (812)463-87-10
НАЧАЛЬНИК ОТДЕЛА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

Любина Евгения Валерьевна

Тел. (812)573-92-67
Колпино, б-р Победы, д.1, каб.72

ГЛАВНЫЙ ВРАЧ СПб ГБУЗ «Стоматологическая поликлиника № 18»

Алескеров Джавад Шахинович

Тел./факс (812)461-77-22
Ул.В.Слуцкой, д.9, каб. №1
Прием по личным вопросам:
Вторник с 14 до 15 часов

(по предварительной записи)
e-mail: [email protected]

ЗАМ. ГЛАВНОГО ВРАЧА по медицинским вопросам 

Жеребцова Вера Васильевна

Тел.(812)461-77-22
Ул.В.Слуцкой, д.9, каб. №1
Прием по личным вопросам:
Понедельник и пятница
с 16 до 17 часов

e-mail: [email protected]

ЗАВЕДУЮЩИЙ ХИРУРГИЧЕСКИМ ОТДЕЛЕНИЕМ 

Поляков Сергей Александрович

Тел. (812)461-19-20
Ул.В.Слуцкой, д. 9, каб. № 6

e-mail: [email protected]

ЗАВЕДУЮЩАЯ ЛЕЧЕБНЫМ ОТДЕЛЕНИЕМ 

Шефер Светлана Леонидовна

Тел.(812)461-19-20
Ул.В.Слуцкой, д. 9, каб. № 6

e-mail: [email protected]

ЗАВЕДУЮЩАЯ ДЕТСКИМ ОТДЕЛЕНИЕМ 

Лебедева
Наталия Эдуардовна

Тел. (812)461-11-75
Ул.В.Слуцкой, д.9, каб. №3

e-mail: [email protected]

ЗАВЕДУЮЩАЯ ЗУБОПРОТЕЗНЫМ ОТДЕЛЕНИЕМ

Башкирова Марина Анатольевна

Тел. (812)463-87-11
Ул.Тверская, д. 48, каб. № 6
Прием по личным вопросам:
Среда с 17 до 18 часов.

e-mail: [email protected]

Прокуратура Колпинского района Санкт-Петербурга Почтовый адрес:196655, Санкт-Петербург, Колпино, ул.Культуры, д.8,
ОМВД России по Колпинскому району г.Санкт-Петербурга Почтовый адрес: Санкт-Петербург, Колпино, ул. Труда, д.6 тел.573-05-30
Уполномоченный по правам ребенка в Санкт-Петербурге Митянина Анна Владимировна,
телефон/ факс 576-70-00. Прием граждан по адресу: г. Санкт-Петербург, пер. Гривцова, дом 11, среда с 14:00 до 18:00.
Запись на личный прием к Уполномоченному по правам ребенка в Санкт-Петербурге 576-70-00

9002862e 18 Контакт Auto герметичный розеточную часть разъема жгута проводов

 

Название продукта Автоматический разъем
Согласно спецификации 9002862E герметичный 18 контактный гнездовой провод жгута проводов разъема авто  
Исходный номер 9002862E
Материал Корпус: PBT+G, PA66+GF; Терминал: Сплав меди и латуни
Размер 10*10*10 см
Мужчин и женщин Женщины
Количество позиций 18 Контакт
Герметичный/запечатан Герметичный
Цвет Черный

Диапазон рабочих температур

-40ºC~120ºC

Функции

Сертификация T/S сертификацию TS16949, ISO14001
MOQ Небольшой порядок может быть принято.
Срок оплаты 30 % предоплата заранее, 70% до отгрузки, 100% T/T заранее
срок поставки производственная мощность запастись достаточным количеством и своевременной доставки.
Упаковка 100/200/300/500/1000ПК на мешок с label, экспорт стандартную коробку.

Дизайн  Способность        

Мы способны  Поставлять образец, OEM и ODM  — добро пожаловать

Наши детализации снимков:


описание продукта
1.     9002862E герметичный 18 контактный  Гнездовой провод жгута проводов разъема авто

2. Мы также может производить много из этих же провод жгута проводов с очень конкурентоспособной цене.

3. Все виды авто разъемы» материалы RoHS соблюдения

4. Материалов: PA66 для разъемов; Медных или stailess сталь для клемм

5. MOQ: 100 ПК для этого провода жгута проводов

6. Мы также могут предоставлять все детали для жгута проводки, разъемов и клемм, уплотнения, кабели, сжатого воздуха и так далее.

7. Мы также может предоставить Вам пресс-служба в целях развития для питания элементов, которые вы не можете найти непосредственно в corrent рынка.

8. Наши жгут проводов очень популярным в мире рынок. Они были экспортированы во Франции, в США, Австралии, Германии, Канады, Бельгии, на Ближнем Востоке, Тайвань, Таиланд и так далее.
 

*Предложение доставки:  

Небольшое количество

(Образец, но зарядка)

Быстрый и удобный способ:

С EMS, DHL и UPS, которые имеют Honha дисконтная цена для вас это очень быстрый и удобный, отправки в вашей компании.

По воздуху, его можно отправлять только на станции airport, но для тяжелых с тем, она позволяет сэкономить расходы и быстро.

Большие количества

Быстрый и удобный способ:

Если вы хотите отправить все элементы так быстро, как это может быть, а затем попробуйте Honha, fedex, DHL, UPS и TNT или воздушным транспортом, который может управлять Honha она будет ниже.

Немного медленно, но дешевый:

Если вы не торопитесь, Honha может попробуйте отправить на море, очень дешево, Honha может помочь вам обратиться в транспортную компанию, расположите судна.
Наши услуги

Что мы могли бы сделать для вас:        

  1) на заводе продавать непосредственно    

  2) долгосрочной, быстрого и стабильного предоставления возможности      

  3) срок поставки: 1 — 2 рабочих дней    

  4) как с вашими требованиями на упаковке, торговой марки или другие проекты

  5) решительной политики продвижения по службе при послепродажном обслуживании    

  6) ex-заводская цена и конкурентоспособной цене      

  7) мы может предоставить бесплатные образцы.

  8) в ответ вы asap. (ответит вам 10-20 минут на основе к вам требуется).

 

Почему стоит выбрать Honha

1. Превосходное обслуживание перед покупкой

  Honha  Знать, какие наиболее эффективные с точки зрения затрат в запасные части. В зависимости от  Обстоятельств клиентов,

Мы будем рекомендовать наиболее подходящих для них деталей.

  2. Гарантия качества

  Большинство продуктов, Honha продаются во всем мире с высоким качеством и также предоставить гарантии безопасности.

  3. Богатый опыт и ресурсы различных производителей

Honha имеет огромные ресурсы различных производителей и дистрибьюторов. Мы смогли не только в больших количествах, но также мы можем организовать небольшое количество сложных порядка, а также.


Наш пакет изображение:

Дисплей:







Контактные данные:

 

Государственное бюджетное дошкольное образовательное учреждение детский сад №18 Невского района Санкт-Петербурга

Юридический/фактический/почтовый адрес:
193230, Санкт-Петербург, ул. Крыленко, д. 21, корп.3 литера А

Режим работы образовательной организации: с понедельника по пятницу
Выходные: суббота, воскресенье и праздничные дни, установленные законодательством Российской Федерации
График работы: с 07:00 до 19:00

Заведующий — Никулина Ирина Анатольевна
телефон 8 (812) 585 — 36 -24    
E-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

приемный день: вторник с 15.00 до 18.00

 

Делопроизводитель 

Высоцкая Екатерина Васильевна

прием ежедневно  с 9.00 до 10.00  и с 15.00 до 17.00 

 вторник и четверг с 10.00 до 12.00 и с 14.00 до 17.00

по превдарительной записи по телефону: 585-36-24 электронная почта: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Медицинский кабинет
телефон 8 (812) 585-97-26
часы работы с 08:00 до 15:30

Отдел образования администрации Невского района
http://nevarono.spb.ru/ 

Горячая линия по вопросам дошкольного образования
8 (812) 417-37-39 (понедельник с 10:00 до 12:00)
8 (812) 417-37-33 (среда с 10:00 до 12:00)

Горячая линия комиссии по комплектованию дошкольных образовательных учреждений
8 (812) 242-31-84  (вторник с 15.00 до 18.00  чт с 10.00 до 12.00)
(пн,вт,ср,пт с 12:00 до 15:00)

Начальник отдела образования администрации Невского района
Чалганская Любовь Ивановна, каб. 34 
телефон приемной: 576-98-71, факс 417-37-30
e-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.
приемный день: вторник, 16.00-18.00 (по предварительной записи)

Структура аппарата отдела образования — открыть страницу на сайте Отдела образования
График приёма граждан, консультации — открыть страницу на сайте Отдела образования
Кураторство по муниципальным округам — открыть страницу на сайте Отдела образования

Горячая линия Комитета по образованию Правительства Санкт-Петербурга
Адрес: 190000, Санкт-Петербург, пер. Антоненко, д. 8 Телефон: 570-31-79, 570-38-29 (факс)
Телефон горячей линии: 576-20-19 E-mail: Этот адрес электронной почты защищён от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

1/18 Контакт | Ридли

Карл Эдуард Саган

Контакт

Карл Саган

Контакт

Александре, совершеннолетие которой совпадает с окончанием тысячелетия.

Да примет ваше поколение мир от нас в лучшем виде, чем унаследовали мы от отцов.

Часть первая

Послание

Мое сердце трепещет как лист.

В снах моих – круженье планет,

Обступили звезды постель:

Я вращаюсь и сплю,

Ты, Земля, – моя колыбель.

Марвин Мерсер. Школа № 153, 5-й класс, Гарлем, г. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, 1981 г.

1. Трансцедентные числа

Жаль мотылька!

Моя рука

Нашла его

В раю цветка.

Мой краток век.

Твой краток срок.

Ты человек.

Я мотылек.

Порхаю, зная:

Сгребет, сметет

Рука слепая

И мой полет.

Уильям Блейк. «Мотылек» (1795)[перевод В. Топорова]

По людским понятиям, сооружение размером с целую планету не могло быть искусственным. Но настолько странной и сложной была форма таинственного объекта, настолько очевидным было в нем некое загадочное предназначение, что нельзя было сомневаться – только разум мог породить колоссальный неправильный многогранник, усыпанный миллионами чашевидных нашлепок, что кружил по полярной орбите вокруг иссиня-белой звезды. Каждая чаша была устремлена в определенную точку неба. Не было забыто ни одно созвездие. Таинственное дело свое планета-многогранник творила не эры – эоны. Планета была терпелива. Она могла ждать вечно…

Явившись в мир, она и не думала плакать. Ее крошечный лобик наморщился – и глаза открылись. Она поглядела на яркий свет, на зеленые и белые силуэты, на женщину, лежавшую на столе. Ее омывали казавшиеся знакомыми звуки. Выражение на лице девочки было, пожалуй, несколько неожиданным для новорожденной: удивленное и озадаченное.

Однажды при гостях, когда девочке уже исполнилось два года, она подняла вверх обе ручонки и потянулась к отцу, нежным голоском повторяя:

– Папа, вверх.

Друзья удивились спокойствию и благовоспитанности ребенка.

– Она уже привыкала визжать, когда просилась на руки, – пояснил отец, – но я как-то попросил: «Элли, не надо. Просто скажи: “Папа, вверх”.» Дети смышлены. Так ведь, Тинка?

Сейчас она была как раз наверху, на головокружительной высоте – на отцовских плечах, – и крепко держалась за его редеющие волосы. Здесь девочка чувствовала себя спокойнее, чем посреди вечно расхаживающих ног. Внизу на нее могли и наступить. Можно было и потеряться. Поэтому она вцепилась покрепче.

Отойдя от обезьян, папа с дочкой обогнули угол и оказались возле громадного зверя на ногах-ходулях и с длиннющей шеей… На голове животного росли крошечные рожки, голова же башней возвышалась над ними.

– Видишь ли, у жирафов такие длинные шеи, что слова не успевают добраться до рта, – объяснил отец.

Элли пожалела немого беднягу, но почувствовала и радость оттого, что такой зверь существует, и восхищение перед подобным чудом.

– Ну же, Элли, – мягко поторопила ее мать. В знакомом голосе чувствовалось воодушевление. – Читай.

Сестра матери так и не поверила, что в три года Элли уже выучилась читать. Тетя решила, что девочка просто запоминает сказки. Пока в одно прохладное мартовское утро они, прогуливаясь вместе по Стейт-стрит, не остановились перед витриной. За стеклом каплей вина рдел красный камень.

– Ю-ве-лир, – медленно прочла Элли, разделив слово на три слога.

Крадучись, она вошла в кладовую. Старый приемник «Моторола» оказался на своем привычном месте, большой и тяжелый; подняв, девочка едва не выронила его. Сзади были слова: «Опасно. Не снимать». Но Элли уже знала: пока его не включишь в сеть, опасности нет. Чуть высунув язычок, она отвинтила винты и сняла крышку. Как Элли и подозревала, внутри не оказалось ни крошечных оркестриков, ни куколок-дикторов, спокойно ожидающих, когда нажатие кнопки оживит их. Там были только блестящие стеклянные цилиндры, чем-то похожие на электролампы. Некоторые напоминали главы московских церквей, которые она видела в книжке. Штырьки в основании цилиндров прекрасно входили в отверстия платы. Поставив крышку на пол, Элли включила приемник и вставила вилку в розетку. Что может случиться, если она не будет ничего трогать и даже не подойдет близко?

Через пару секунд трубки засветились теплым светом, но звука не было. Радио когда-то «сломалось», и приемник убрали, заменив на новый. Только одна из трубок оставалась темной. Элли выключила приемник из сети, выковыряла непослушный цилиндрик из гнезда. За стеклом виднелся металлический прямоугольник, к которому подходили тонкие провода. Электричество бежит по проволочкам, смутно подумалось ей. Но еще ему нужно попасть в трубку. Один из штырьков оказался изогнутым. Немного потрудившись, Элли сумела выпрямить его. Вставив цилиндрик на место, она вновь включила приемник в сеть и с восторгом увидела, что лампа засветилась, а в кладовой послышался треск помех. Вздрогнув, девочка поглядела на закрытую дверь и уменьшила громкость. Она повернула рукоятку с надписью «Частота» и услышала взволнованный голос: речь шла о новой русской машине, что кружила в небесах вокруг Земли. Кружит и кружит, подумала она. Слегка повернув рукоятку, она поискала другую станцию. Потом, опасаясь, что ее застанут врасплох, выключила приемник и, чуть завернув винты на задней крышке, поставила его обратно на полку.

Когда она, немного волнуясь, вышла из кладовой, навстречу ей попалась мать, и девочка вздрогнула.

– Элли, все в порядке?

– Да, мам.

Вид у нее был непринужденный, но сердце колотилось и ладони потели. Потом она устроилась в любимом укромном уголке на небольшом заднем дворе и, уткнувшись носом в коленки, задумалась… о приемнике. Действительно ли нужны все эти трубки? Отец называл их вакуумными лампами. Что происходит внутри них? Неужели там и в самом деле нет воздуха? А как музыка оркестров и речи дикторов попадают внутрь приемника? Взрослые говорили – по воздуху. Разве радио летит по воздуху? Что происходит внутри приемника, когда переключаешь станции? И что такое «частота»? Почему надо включать приемник в розетку, чтобы он заработал? А нельзя ли начертить карту, на которой будет видно, как электричество двигается внутри приемника? Можно ли разобрать его не поранившись? А потом снова собрать?

– Элли, что с тобой? – спросила мать, проходя мимо с отжатым бельем к веревке.

– Ничего, мам. Просто думаю.

Когда ей шел десятый год, они уехали на каникулы в гости к двум двоюродным братьям – Элли их не выносила – пожить на побережье северного полуострова у озера Мичиган. Зачем нужно оставлять свой дом в Висконсине и ехать целых пять часов на другой берег того же самого озера, было за пределами ее понимания. Тем более не стоило этого делать ради общения с двумя неразвитыми и ребячливыми мальчишками. Десять и одиннадцать лет. Младенцы. Как мог отец, всегда так внимательно относившийся к ней, обречь ее на постоянные игры с этими грубиянами? И все лето она провела, старательно избегая общества кузенов.

Однажды после ужина, темной безлунной ночью, она спустилась к деревянному причалу. Только что отчалила моторка, и привязанная к причалу весельная лодка дяди еще покачивалась на освещенной звездным светом воде. Она поглядела вверх, на усыпанное бриллиантами небо, и сердце ее затрепетало.


Свяжитесь с нами | Поддержка | Аргон 18

Страна

SelectAfghanistanAland IslandsAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntarcticaAntigua И BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamas TheBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia и HerzegovinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBruneiBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCanadaCape VerdeCayman IslandsCentral африканских RepublicChadChileChinaChristmas IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongoCongo Демократическая Республика TheCook IslandsCosta RicaCote д’Ивуар (Берег Слоновой Кости) Хорватия (Hrvatska) CubaCyprusCzech RepublicDenmarkDjiboutiDominicaDominican RepublicEast TimorEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial ГвинеяЭстонияЭфиопияФолклендские островаФарерские островаФиджи ФинляндияФранцияФранцузская ГвианаФранцузская ПолинезияФранцузские Южные ТерриторииГабонГамбияГрузияГерманияГанаГибралтарГрецияГренландияГренадаГваделупаГуамГватемалаГернси и ОлдерниГвинеяГвинея-БисауГ uyanaГаитиОстрова Херд и МакдональдГондурасГонконг С.ARHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsraelItalyJamaicaJapanJerseyJordanKazakhstanKenyaKiribatiKorea KoreaKuwaitKyrgyzstanLaosLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacau SARMacedoniaMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMan север-юг (остров) Маршалл IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesiaMoldovaMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueMyanmarNamibiaNauruNepalNetherlands AntillesNetherlandsNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPalestinian Территория OccupiedPanamaPapua новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairn IslandPolandPortugalPuerto RicoQatarReunionRomaniaRussiaRwandaSaint HelenaSaint Киттс И NevisSaint LuciaSaint Пьер и MiquelonSaint Винсент и GrenadinesSaint-BarthelemySaint-Мартин (французская часть) SamoaSan MarinoSao Томе и PrincipeSaudi ArabiaSenegalSerbiaSeychellesSierra ЛеонеСингапурСловакияСловенияСоломоновы островаСомалиюг ч AfricaSouth GeorgiaSouth SudanSpainSri LankaSudanSurinameSvalbard и Ян Майен IslandsSwazilandSwedenSwitzerlandSyriaTaiwanTajikistanTanzaniaThailandTogoTokelauTongaTrinidad И TobagoTunisiaTurkeyTurkmenistanTurks И Кайкос IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited Арабские EmiratesUnited KingdomUnited StatesUnited Штаты Экваторияльная IslandsUruguayUzbekistanVanuatuVatican City State (Святой Престол) VenezuelaVietnamVirgin острова (Британские) Виргинские острова (США) Уоллис и Футуна IslandsWestern SaharaYemenZambiaZimbabwe

Пожалуйста, введите допустимое значение

Профилактика аллергического контактного дерматита ядовитого плюща и ядовитого дуба с помощью бентонита кватерния-18

Задний план: Ядовитый плющ и ядовитый дуб являются наиболее распространенными причинами аллергического контактного дерматита в Северной Америке.

Цель: Мы исследовали, предотвращает ли новый лосьон для местного применения, содержащий 5% бентонита кватерниума-18, экспериментально вызванный аллергический контактный дерматит, вызванный ядовитым плющом и ядовитым дубом.

Методы: Для оценки эффективности и безопасности бентонитового лосьона quaternium-18 в профилактике экспериментально индуцированного аллергического контактного дерматита, вызванного ядовитым плющом и ядовитым дубом, у восприимчивых добровольцев было проведено одно-слепое парное сравнительное рандомизированное многоцентровое исследование.За час до того, как оба предплечья были протестированы с урушиолом, аллергенной смолой ядовитого плюща и ядовитого дуба, на одно предплечье нанесли 5% бентонитовый лосьон кватерниум-18. Тестовые пластыри удаляли через 4 часа, а места реакции интерпретировали через 2, 5 и 8 дней. Статистически анализировали разницу в реакциях между обработанными и необработанными участками пластыря.

Результаты: Было исследовано 211 человек с аллергическим контактным дерматитом на ядовитый плющ и ядовитый дуб в анамнезе.У 144 испытуемых была положительная реакция на урушиол. На тестовых участках, предварительно обработанных бентонитовым лосьоном quaternium-18, реакция на урушиол отсутствовала или была значительно снижена по сравнению с необработанными контрольными участками (p < 0,0001) во все дни испытаний. Когда это происходило, реакция последовательно появлялась позже на обработанных, чем на контрольных участках (p < 0,0001). Единственным побочным эффектом бентонитового лосьона quaternium-18 было одно появление легкой преходящей эритемы в месте нанесения.

Заключение: Бентонитовый лосьон Quaternium-18 был эффективен в предотвращении или уменьшении экспериментально полученного аллергического контактного дерматита, вызванного ядовитым плющом и ядовитым дубом.

Часто задаваемые вопросы: как активировать уведомления о заражении коронавирусом на вашем телефоне

Но уведомления о заражении работают только в том случае, если вы и окружающие вас люди включите их.Да ты!

Есть ранние свидетельства того, что эта технология анонимных смартфонов работает, но пока не помогает очень многим американцам. В августе 2020 года я написал о первом из этих предупреждений, спонсируемых государством, о приложении Covidwise в Вирджинии. В последующие три месяца только 488 человек использовали приложение штата, чтобы отправлять оповещения о положительном диагнозе другим.

Оповещения используют программное обеспечение, встроенное Apple и Google в устройства iPhone и Android, чтобы определять, когда люди (или телефоны, которые они держат) вступают в тесный контакт друг с другом.Это может звучать как вторжение в частную жизнь, но они придумали, как отслеживать встречи между людьми анонимно — и не сохраняя ваше местоположение — с помощью беспроводной технологии Bluetooth в телефонах. С обновлением iOS в декабре 2020 года он теперь работает на телефонах, начиная с iPhone 6.

История продолжается ниже рекламного объявления

«Это не будет серебряной пулей, но это еще один инструмент в наборе инструментов, — сказал Майкл Уилкенинг, специальный советник губернатора Калифорнии по инновациям и цифровым услугам.Это помогает заполнить пробелы, оставленные традиционным отслеживанием контактов, которое требует от пациентов вспомнить, где они были, и знать, кого они могли заразить.

Оповещения о воздействии сработали для губернатора Вирджинии Ральфа Нортама. Он и первая леди дали положительный результат на коронавирус в прошлом году, и, поскольку он работал на их телефонах, сотрудники, подвергшиеся их воздействию, были уведомлены.

Так почему же наши телефоны не играют большой роли в борьбе с коронавирусом в Америке? Во-первых, местный департамент здравоохранения каждого штата должен разработать и использовать свою собственную систему (хотя они начали заставлять их работать за границей).Обеспокоенность конфиденциальностью похожих — но на самом деле очень разных — приложений для отслеживания контактов напрасно отпугивает людей. И, честно говоря, Apple и Google похоронили настройки и приложения, которые вам понадобятся, испортив то, что могло бы стать самым полезным техническим запуском года.

История продолжается под рекламой

Вам нечего терять, поэтому вы можете включить оповещения о риске заражения. Настройка занимает менее пяти минут, и это руководство поможет.

Как я могу получать предупреждения о заражении коронавирусом там, где я живу?

По состоянию на дек.29, 27 штатов и территорий США, а также округ Колумбия поддерживают оповещения о воздействии коронавируса. Чтобы получить инструкции, щелкните ссылку рядом с каждым регионом, чтобы перейти на веб-сайт, созданный местными органами здравоохранения:

Страны по всему миру также используют аналогичную технологию Bluetooth для уведомлений, включая Швейцарию, Ирландию, Северную Ирландию, Шотландию и Англия.

Моего состояния нет в этом списке. Могу ли я получать уведомления, когда уведомления о воздействии становятся доступными?

Следите за сообщениями местного отдела здравоохранения.Я также обновлю список выше, как только больше появится в сети.

История продолжается под рекламой

Если у вас iPhone, это также может помочь: перейдите в «Настройки», затем «Уведомления о воздействии» и убедитесь, что оповещения о доступности включены.

Государства могут использовать эту систему для отправки уведомлений на ваш телефон, когда их системы заработают. (Для этого у вас должны быть включены службы определения местоположения, чтобы ваш телефон мог сказать, где вы находитесь.)

Нужно ли загружать отдельное приложение?

Это зависит от того, где вы живете и какой у вас телефон.

В большинстве штатов созданы собственные приложения для iPhone и Android, которые помогут вам включить оповещения и, при необходимости, ввести собственный положительный результат теста.

Только для iPhone: в некоторых странах, включая Калифорнию, Колорадо, Мэриленд, штат Вашингтон и округ Колумбия, приложения нет — вам просто нужно активировать его в настройках телефона в разделе «Уведомления о воздействии». Вы даже можете получить push-уведомление на свой телефон с предложением включить его. (Обратите внимание, что это не будет работать для всех штатов — вам все равно может потребоваться загрузить отдельное приложение.)

Как работают уведомления о заражении?

Вы установили его и забыли, пока вы или кто-то из ваших близких не получите положительный результат теста на коронавирус. Это все, что вам действительно нужно знать. Время от времени вы можете получать уведомление, чтобы напомнить вам, что система все еще работает.

Продолжение истории под рекламой

Незаметно ваш телефон постоянно издает небольшие сигналы Bluetooth. На самом деле звука нет, но чириканье содержит анонимный, постоянно меняющийся код, который может быть уловлен другими телефонами, к которым вы приближаетесь.Сигналы также используются для приблизительного измерения расстояния. Чем сильнее сигнал Bluetooth, тем ближе два телефона друг к другу.

Ваш телефон также прислушивается к сигналам, исходящим от других телефонов, и ведет скользящий 14-дневный журнал всех телефонов, к которым вы приближаетесь.

Вы должны оставить свой телефон и Bluetooth включенными, по крайней мере, когда вы находитесь рядом с другими людьми. Не волнуйтесь: в моих тестах все это щебетание и прослушивание не слишком сильно расходуют заряд батареи.(Если вы все еще хотите выключить Bluetooth, когда вернетесь в изоляцию дома, это не повредит, но вам нужно не забыть снова включить Bluetooth, когда вы вернетесь на улицу.)

Если у вас было оповещения включены и в конечном итоге получают положительный тест, вы должны сообщить об этом в местный отдел здравоохранения. Власти дадут вам уникальный код или ключ для входа в ваш телефон.

История продолжается под рекламой

Ввод кода посылает своего рода сигнал летучей мыши, сообщая другим телефонам, чтобы проверить, были ли вы на связи и как долго.

Если был тесный контакт — обычно в пределах шести футов в течение 15 минут или более — тогда на телефоне появится предупреждение, рекомендующее курс действий, включая прохождение теста. (Некоторые системы, такие как система, проходящая испытания в Аризоне, дадут вам знать, если у вас было хотя бы пять минут воздействия.)

Как уведомления о воздействии не нарушают мою конфиденциальность?

Обычно я первый предупреждаю, что мы не должны доверять корпорациям или правительству наши конфиденциальные личные данные.Но после изучения данных, вытекающих из этих спонсируемых государством приложений и сервисов, я не обнаружил особой опасности в их наличии на моем телефоне.

История продолжается под рекламой

И вот почему: эти системы не регистрируют местоположение вашего телефона. Вместо этого они используют умную систему Bluetooth, которая помогает телефонам запоминать, с кем вы были рядом, не зная, где вы находитесь.

Человек, получивший предупреждение, не знает, с кем он столкнулся и даже когда именно это произошло.Даже государственные органы здравоохранения не узнают об этом (что некоторым из них не нравится, потому что это поможет им в отслеживании контактов). Это все анонимно.

Оповещения о воздействии также не будут включены без вашего разрешения. Программное обеспечение, которое заставляет их работать, является частью обновлений до iOS и Android, но оно не будет активировано, пока вы не скажете ему об этом.

Должен ли я включать оповещения о риске заражения, если мой штат не поддерживает это?

Использование системы оповещения другого штата не помешает, но может и не помочь.Вы не получите большой пользы от предупреждений о воздействии, если люди вокруг вас также не включат их. И если ваш фактический местный отдел здравоохранения еще не поддерживает систему, у вас не будет возможности сообщить о своем положительном диагнозе, чтобы предупредить других. (Для этого требуется специальный код от вашего департамента здравоохранения.)

С какими телефонами он работает?

Вам понадобится телефон, на котором можно запускать последние обновления программного обеспечения от Apple и Google, позволяющие получать уведомления о коронавирусе.

История продолжается ниже объявления

Для Apple iPhone: iPhone 6 (начиная с 2014 года) и новее будут работать, если они работают под управлением iOS не ниже 12.5.

Для телефонов Android: вам понадобится Android версии 6, которая поддерживается на телефонах, начиная с Samsung Galaxy S5 (с 2014 года).

Работает ли это, если я живу в многоквартирном доме?

Сигналы Bluetooth не являются идеальным способом измерения экспозиции. Они могут приблизительно измерить расстояние, но мы знаем, что ваш реальный риск заражения сильно зависит от того, находитесь ли вы в помещении или на улице, а также от того, носите ли вы и человек, с которым вы контактируете, маски.

Но пока проживание в квартире не оказалось серьезной проблемой для этой технологии. Сигналы Bluetooth могут проходить сквозь стены, но не очень хорошо. (Просто попробуйте послушать в наушниках Bluetooth по другую сторону стены.) Системы были настроены так, чтобы выделять меньше ложноположительных показаний — это означает, что если вы получите предупреждение, скорее всего, вы были очень близко к кому-то с коронавирусной инфекцией. длительное время.

Что происходит, когда я путешествую или общаюсь с кем-то из другого штата?

Нет проблем.Просто убедитесь, что вы активировали оповещения из штата или территории, где вы сами сдали бы тест на коронавирус. Департамент здравоохранения этого штата предоставит вам коды для ввода положительного результата теста в систему.

История продолжается ниже объявления

Нет необходимости устанавливать приложения из разных штатов. Когда приложения для экспозиции были запущены впервые, все они были независимыми островами. Но теперь они сотрудничают через границы штатов с национальным хранилищем этих ключей положительного диагноза.Это означает, что если вы живете в Нью-Йорке и общаетесь с кем-то из Нью-Джерси, ваш телефон все равно сможет получать оповещения.

Работают ли уведомления о воздействии через Bluetooth?

В настоящее время эту технологию использовали тысячи американцев, у которых был положительный результат на коронавирус, чтобы сообщить другим, что они могли быть заражены. Чего мы не знаем, так это того, сколько людей получили эти уведомления. Это число может быть очень маленьким.

Вирджиния, в которой приложение Covidwise запущено с августа 2020 года, имеет наибольший опыт.По состоянию на ноябрь того же года в Вирджинии было более 770 000 участников — чуть менее 10 процентов населения штата. Из них 777 человек с установленным приложением штата получили положительный результат теста, и только 488 из них ввели свой диагноз в систему, чтобы предупредить других. Вирджиния говорит, что не знает, сколько людей получили предупреждения о потенциальном заражении.

«Вирджиния довольна продолжающейся тенденцией к увеличению количества загрузок», — сказал представитель Джефф Стовер.«Однако мы хотим, чтобы у большинства населения было приложение на их устройствах».

Приложение Пенсильвании было загружено полмиллиона раз за первые два месяца. «Мы действительно считаем, что приложения для уведомления о воздействии через Bluetooth эффективны», — сказала Магги Мумма, заместитель пресс-секретаря Департамента здравоохранения штата.

COVIDWISE использует сигналы Bluetooth, чтобы определить, могли ли вы вступить в контакт с человеком, у которого положительный результат теста на новый коронавирус. (Джонатан Баран/The Washington Post)

Центры по контролю и профилактике заболеваний говорят, что поддерживают исследования эффективности уведомлений о воздействии по телефону.«Мы делаем эту работу, чтобы помочь государствам делать выводы и принимать решения», — сказал официальный представитель Джейсон Макдональд.

Другие страны сообщили о более явных успехах. По данным BBC, в Северной Ирландии по состоянию на конец октября 2020 года более 16 000 человек получили уведомления о карантине после того, как в приложение было введено около 5000 положительных результатов тестов.

Академические исследователи говорят, что в Швейцарии, первой стране, которая использует эту систему уведомлений Bluetooth, ранние данные о людях, получивших уведомления, дают положительный результат, что свидетельствует о том, что технология вносит «соответствующий вклад в смягчение последствий пандемии».

Apple и Google «уведомления о воздействии» могут помочь чиновникам здравоохранения определить, когда человек подвергся воздействию коронавируса, и предупредить находящихся поблизости пользователей смартфонов. (Джонатан Баран, Брайан Монро/The Washington Post)

Почему это не работает лучше?

Это новая технология, и инженеры и органы здравоохранения многое выясняют по ходу работы.

Начнем с того, что смартфоны все-таки не универсальны. Калифорния оценивает только около 70 процентов из 39 штатов.Принять участие могут 6 миллионов человек.

Поэтапное развертывание воплощает в себе многие проблемы, связанные с реакцией Америки на коронавирус. Обращение к каждому штату с просьбой отдельно разработать свои технологии было препятствием в то время, когда министерства здравоохранения ограничены во времени, деньгах, технологиях и маркетинговом опыте. Apple и Google бесплатно разработали базовую технологию, но многие штаты до сих пор пытаются создавать свои собственные приложения. Более новое обновление, называемое «экспресс-системой», позволяет штатам внедрять технологию с меньшими усилиями.(Штат Нью-Йорк запустил свою систему менее чем за 700 000 долларов.)

Инженеры все еще работают над тем, чтобы выяснить, как лучше всего считывать сигналы Bluetooth. Для начала они были настроены так, чтобы свести к минимуму возможные ложные срабатывания. Но теперь они также узнают о том, как сигналы реагируют по-разному, когда люди находятся в помещении, на улице и держат свои телефоны в карманах в любом месте.

«Мы работаем как сообщество, чтобы оптимизировать его и выяснить, как разместить эти настройки в нужном месте, чтобы сбалансировать риск ложных срабатываний с получением уведомлений для людей, находящихся в группе риска», — говорит Дженни Вангер из Linux Foundation Public Health, которая помогает координировать и предоставлять технологии правительствам.

Задача общественного здравоохранения — это также задача маркетинга. Многим людям приходится использовать эту технологию, чтобы она работала, или даже видеть, что нужно настроить, чтобы она работала лучше. Apple и Google помогали государствам продавать их за кулисами, но не включали их в свои собственные рекламные ролики и телевизионные рекламные ролики (в том числе те, которые сомнительно продвигали новые умные часы как «будущее здоровья»). Если они серьезно относятся к этой технологии, спасающей жизни, им действительно следует активизироваться.

Даже если участие ограничено, вы все равно можете извлечь выгоду из активации предупреждений о риске заражения. Исследователи из Оксфордского университета считают, что оповещения могут быть полезны на всех уровнях восприятия. По их словам, участие всего 15 процентов населения может снизить количество инфекций и спасти жизни.

Крис Веласко участвовал в подготовке этого отчета.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Colorado Felony Sexual Crimes Unlawful Sexual Contact (18-3-404)

Любое лицо, сознательно подвергающее жертву любому сексуальному контакту, совершает незаконный сексуальный контакт, если:
  1. Исполнитель знает, что жертва не дает согласия; или
  2. Деятель знает, что потерпевший не способен оценить характер поведения потерпевшего; или
  3. Жертва физически беспомощна, и актер знает, что жертва физически беспомощна и жертва не дала согласия; или
  4. Деятель существенно ограничил способность потерпевшего оценивать или контролировать поведение потерпевшего, применив без согласия потерпевшего наркотики, интоксиканты или другие средства с целью вызвать подчинение; или
  5. Отменено.
  6. Потерпевший находится под стражей или содержится в больнице или другом учреждении, и действующее лицо имеет надзорные или дисциплинарные полномочия в отношении потерпевшего и использует эту власть, если только это не связано с законным обыском, для принуждения потерпевшего к подчинению; или
  7. Деятель занимается лечением или обследованием потерпевшего не в добросовестных медицинских целях или способом, существенно несовместимым с разумной медицинской практикой.

1.5 — Любое лицо, которое сознательно, с сексуальным контактом или без него, побуждает или принуждает ребенка любым из средств, указанных в разделе 18-3-402, к обнажению интимных частей тела или к любому сексуальному контакту, вторжению или проникновение с другим лицом, с целью собственного сексуального удовлетворения актера, совершает незаконный половой контакт.Для целей настоящего подраздела (1.5) термин «ребенок» означает любое лицо в возрасте до восемнадцати лет.

1.7 — Любое лицо, которое сознательно наблюдает или фотографирует интимные части другого лица без согласия этого лица, в ситуации, когда наблюдаемое лицо имеет разумное ожидание уединения, с целью собственного сексуального удовлетворения наблюдателя, совершает незаконные сексуальные действия. контакт. Для целей настоящего подраздела (1.7) «фотография» включает любую фотографию, движущееся изображение, видеокассету, распечатку, негатив, слайд или другой визуальный материал, воспроизведенный механическим, электронным или химическим способом.

18 U.S.C. 2244 – Оскорбительный сексуальный контакт

Федеральные адвокаты по уголовным делам, базирующиеся в Конкорде и Шарлотте

Правительство принимает множество мер для предотвращения причинения вреда сексуального характера лицам, содержащимся под стражей или заключенным в федеральных учреждениях. Таким образом, участие в сексуальных действиях с людьми, находящимися в исправительных учреждениях или заключенных, а также вступление в любые половые контакты с такими лицами является преступлением. Осуждение за оскорбительный сексуальный контакт может непоправимо изменить свободу и репутацию человека, и важно, чтобы люди, обвиняемые в оскорбительном сексуальном контакте, понимали права, которые им предоставляет закон.Федеральные адвокаты по преступлениям на сексуальной почве Шарлотты и Конкорда в юридической фирме Олсински умеют помогать людям, обвиняемым в преступлениях, защищать свои интересы, и если вас обвиняют в оскорбительном сексуальном контакте, мы можем активно выступать в вашу защиту.

Преступление оскорбительного сексуального контакта в соответствии с федеральным законом

В соответствии с федеральным законом лицо может быть обвинено в совершении преступления за участие в определенных видах сексуального контакта с другим лицом. Другими словами, в соответствии с разделом 2244 (a) Кодекса США 18, сознательное вступление в половой контакт с кем-либо другим лицом является незаконным, если это нарушило бы другие федеральные законы, если бы контакт был половым актом.Сексуальный контакт определяется как преднамеренное прикосновение к определенным областям другого человека, таким как гениталии, грудь, внутренняя поверхность бедер или ягодицы, либо поверх одежды человека, либо через нее. Прикосновение должно совершаться с намерением унизить, беспокоить или оскорбить человека или пробудить или удовлетворить желание сексуального характера.

Законы, к которым относится раздел 2244(a), — ​​это разделы 2241 (положение о сексуальном насилии при отягчающих обстоятельствах), 2242 (которое относится к сексуальному насилию) и 2243 (которое относится к сексуальному насилию над несовершеннолетним или подопечным).Примечательно, что все разделы 2241, 2242 и 2243 криминализируют сексуальные отношения со взрослыми или детьми, которые задержаны или заключены в федеральную тюрьму или в учреждение, которое содержит людей под стражей в соответствии с контрактом с федеральным департаментом или агентством.

Раздел 2244(b) запрещает любому лицу, находящемуся в федеральной тюрьме или учреждении или учреждении, где люди содержатся под стражей на основании контракта с федеральным правительством, сознательно вступать в половой контакт с другим лицом без разрешения этого лица .Другими словами, лицо может быть осуждено за оскорбительный сексуальный контакт, даже если он не будет представлять собой нарушение другого федерального закона, если контакт был актом.

Наказания за оскорбительные половые контакты

Наказания за осуждение в соответствии с разделом 2244 различаются в зависимости от основного преступления, в котором подсудимый мог бы быть обвинен, если бы сексуальный контакт был сексуальным актом. В частности, если прикосновение нарушило бы раздел 2241 (a) или (b), оно наказывается лишением свободы на срок до 10 лет, а если бы контакт привел к осуждению в соответствии с разделом 2241 (c), если бы это был акт. , это может привести к пожизненному заключению.Если контакт нарушил бы раздел 2242, максимальное наказание составляет три года тюремного заключения, а нарушение раздела 2243 может привести к тюремному заключению на срок до двух лет. В случаях, когда предполагаемой жертве не исполнилось 12 лет, наказание может быть удвоено. Наконец, лицо, осужденное по статье 2244(b), может быть приговорено к лишению свободы на срок до двух лет.

Обратитесь к опытному адвокату в Конкорде или Шарлотте

Половая активность широкого спектра является незаконной, если она происходит в государственном или финансируемом государством учреждении или тюрьме, включая определенные половые контакты.Если вас обвиняют в оскорбительном сексуальном контакте в нарушение федерального закона, вам следует нанять адвоката, который будет неустанно бороться от вашего имени. Опытные адвокаты по уголовным делам в Olsinski Law Firm умеют защищать людей, обвиняемых в федеральных преступлениях на сексуальной почве. Мы помогаем людям, обвиняемым в федеральных преступлениях на сексуальной почве в Конкорде и Шарлотте, а также в округах Кабаррус и Мекленбург, в том числе в Хантерсвилле, Минт-Хилле, Мэтьюзе, Корнелиусе, Дэвидсоне, Мидленде, Пайнвилле, Гаррисберге, Каннаполисе и Маунт-Плезант.Вы можете связаться с нами, чтобы назначить консультацию через нашу онлайн-форму или в нашем офисе в Шарлотте, позвонив по телефону 704-405-2580, или в нашем офисе Concord, позвонив по телефону 704-918-4747.

Независимое от контакта уничтожение, опосредованное эффектором T6SS с присущими ему свойствами проникновения в клетку

Заявление об этике

Все экспериментальные процедуры на мышах проводились в соответствии с Положением об управлении делами, касающимися экспериментальных животных, утвержденным Государственным советом Народной Республики Китая.Протокол был одобрен Комитетом по благополучию животных и этике исследований Северо-Западного университета A&F (номер протокола: NWAFUSM2018001). Шестинедельные самки мышей (BALB/c) были приобретены в центральной лаборатории животных Сианьского университета Цзяотун (Сиань, Китай) и содержались при температуре (24 ± 2 °C), влажности 50 ± 10%. , поток воздуха 35 обменов и помещение с регулируемым освещением (12 часов света, 12 часов темноты) со свободным доступом к пище и воде.

Штаммы бактерий и условия роста

Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 1.Штаммы Yptb выращивали в среде YLB (1 % триптона, 0,5 % дрожжевого экстракта, 0,5 % NaCl) или среде M9 (Na 2 HPO 4 , 6 мкг/л -1 ; KH 2 PO

2). , 3 г Л -1 ; NaCl, 0,5 г Л -1 ; NH 4 CL, 1 г Л -1 ; MgSO 4 , 1 мм; CaCl 2 , 0,1 мм; глюкоза 0,2%) при 26 °С или 30 °С. Е. coli и S . Typhimurium культивировали в бульоне LB при 37°С или 26°С. В питательную среду были включены соответствующие антибиотики в соответствующих концентрациях: ампициллин (100 мкг мл –1 ), налидиксовая кислота (20 мкг мл –1 ), канамицин (50 мкг мл –1 ), тетрациклин (5 мкг мл −1 для Yptb и 15 мкг мл −1 для E.coli ), гентамицин (20 мкг мл -1), хлорамфеникол (20 мкг мл -1).

Конструкция плазмиды

Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 2. Для получения экспрессионных плазмид гены, кодирующие Yptb Tce1 (YPK_0954), амплифицировали с помощью ПЦР. Фрагмент ДНК расщепляли и клонировали в аналогично расщепленные векторы pGEX6p-1 и pET28a, получая соответствующие производные плазмиды. Тем же методом были получены экспрессионные клоны Tci1 (YPK_0955), BtuB (YPK_0782), OmpF (YPK_2649), TolB (YPK_2956).Что касается выражения плазмиды PET28A- TCE1 GFP GFP GFP , Primarers TCE1- F -BAM HI и TCE1- R -CO RI (TAA) были использованы для усиления TCE1 без условного кодона TAA и GFP- F- Eco RI и GFP- R- Sal I использовали для амплификации фрагмента gfp . Расщепленные фрагменты встраивали в pET28a с получением pET28a- tce1 gfp . Плазмиду pDM4-Δ tce1 , используемую для конструирования мутанта Δ tce1 с внутрирамочной делецией, получали с помощью ПЦР с перекрытием.Вкратце, восходящий фрагмент длиной 800 п.н. и расположенный ниже фрагмент длиной 800 п.н. tce1 амплифицировали с парами праймеров tce1- M1F -Bam HI/ tce1- M1R и tce1-/29018 tce1-29018. M2R -Сал I соответственно. ПЦР-фрагменты выше и ниже по течению сливали с парой праймеров tce1- M1F -Bam HI/ tce1- M2R -Sal I с помощью ПЦР с перекрытием. Полученные продукты ПЦР расщепляли Bam HI и Sal I и встраивали в аналогичную расщепленную суицидную плазмиду pDM4 с получением pDM4-Δ tce1 .Нокаут-плазмида pDM4-Δ tci1 , pDM4-Δ btuB , pDM4-Δ ompF , pDM4-Δ ypk_2801-2802 была сконструирована аналогичным образом с использованием праймеров, перечисленных в дополнительной таблице 2. плазмид, используемых в бактериальных двухгибридных анализах комплементации, гены для тестирования амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК Yptb с использованием соответствующих праймеров. Амплифицированные фрагменты ДНК расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали в соответствующие сайты векторов pKT25 и pUT18C соответственно.Плазмиду pTargetF1-Δ btuB Ec использовали для конструирования Δ btuB Ec с внутрирамочной делецией мутанта в DH 588 E. coli 901α. Чтобы сконструировать pTargetF1-Δ btuB , выше и ниже гена btuB Ec амплифицировали с помощью ПЦР с использованием пар праймеров B3966-up-F/B3966-up-R и B3966-down-F/B3966-down -R соответственно. Фрагмент ДНК, который кодирует btuB Ec , нацеленную на sgRNA, был получен с помощью ПЦР против pTargetF1 с использованием пары праймеров B3966-g20-F/B3966-g20-R.Перекрывающуюся ПЦР использовали для объединения этих трех частей в порядке sgRNA-Up-Down, и полученную сборку лигировали с pTargetF1, предварительно расщепленным с помощью Spe I/ Sal I, используя Gibson Assembly. Аналогичным способом была получена плазмида pTargetF1-Δ ompF Ec . Для комплементации мутанта Δ tce1 использовали праймеры tce1 -F- Bam HI и tce1 -R- Sal I для амплификации фрагмента геномной ДНК tce1 7 18 Ypt 80188 из геномной ДНК tce1 Ypt .Продукт ПЦР расщепляли Bam HI/ Sal I и лигировали в аналогично расщепленный pKT100 с получением pKT100- tce1 . Взаимодополняющие плазмиды pKT100- tci1 , pKT100- btuB , pKT100- tolB , pKT100- OmpF , pKT100- btuB Ec и pKT100- OmpF Ec были аналогично устроен. Плазмида pME6032- tce1 vsvg была сконструирована для анализа секреции белка.Вкратце, праймеры tce1 -F- Eco RI и tce1 -R-VSVG- Bgl II использовали для амплификации гена tce1 из геномной ДНК Yptb . Продукт ПЦР расщепляли Eco RI/ Bgl II и вставляли в расщепленную аналогичным образом pME6032 с получением pME6032- tce1 vsvg . Таким же образом были сконструированы pME6032- ypk_0952 vsvg и pME6032- tci1 . Целостность вставки во всех конструкциях была подтверждена секвенированием ДНК.

Делеция и комплементация внутри рамки считывания

Для конструирования мутантов с делецией внутри рамки производные pDM4 трансформировали в Yptb через E. coli S17-1 λpir-опосредованное конъюгационное скрещивание, достигнутое путем смешивания 50 мкл объемов ночного LB культуры донора E. coli S17-1 λpir с родителем Yptb . Смесь наносили на неселективный планшет LB и инкубировали в течение 16 часов при 30 °C для спаривания. Интеграцию введенной плазмиды в хромосому Yptb путем однократного кроссинговера отбирали на чашках YLB, содержащих 20 мкг мл -1 хлорамфеникола и 20 мкг мл -1 налидиксовой кислоты.Колонии, устойчивые к хлорамфениколу, выращивали в течение ночи в бульоне LB, что позволяло осуществить второй кроссинговер. Селекцию на предмет потери интегрированной в геном плазмиды, содержащей sacB , проводили на чашках YLB, содержащих 20% сахарозы и 20 мкг мл -1 налидиксовой кислоты. Штаммы, растущие на этой чашке, тестировали на чувствительность к хлорамфениколу путем параллельного нанесения пятен на чашки YLB, содержащие либо хлорамфеникол, либо налидиксовую кислоту. Колонии, чувствительные к хлорамфениколу и устойчивые к сахарозе, были проверены на делецию с помощью ПЦР и подтверждены секвенированием ДНК 39,40 .Для сверхэкспрессии или комплементации в соответствующих штаммах Yptb производные pME6032 или pKT100 трансформировали в соответствующие штаммы Yptb с помощью электропорации, а экспрессию в Yptb индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). .

Сгруппированные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы с системой Cas9 (CRISPR-Cas9) использовали для конструирования делеционных мутантов в E. coli DH5α в соответствии с методом, описанным ранее 41 , с заменой гена устойчивости к спектиномицину в плазмиде pTargetF на ген устойчивости к хлорамфениколу (pTargetF1).Производные pTargetF1, несущие sg-upstream-downstream, подвергали электропорации в E. coli , предварительно перенесенных вектором pCas, при 30 °C. Мутантные колонии отбирали на чашках LB, содержащих 50 мкг мл -1 канамицина и 20 мкг мл -1 хлорамфеникола. Плазмиды Ptargetf и PCA в BTUB EC EC EC EC EC EC EC

EC EC Mutant были подряд ликвырены индукцией IPTG (1 мм) при 30 ° C и инкубации в течение ночи при 37 ° С соответственно 42 .После отверждения серии pTarget и плазмид pCas делеционные мутанты были транс-комплементированы pKT100, несущими их соответствующие гены.

Сверхэкспрессия и очистка рекомбинантных белков

Для экспрессии и очистки His 6 и GST-меченых рекомбинантных белков производные pET28a и pGEX6P-1 трансформировали в E. coli BL21(DE3) и E. coli XL 9018 -1 синий соответственно. Бактерии культивировали в 5 мл LB при 37 °C для достижения стационарной фазы и повторно инокулировали в соотношении 1:100 в свежий LB, культивировали при 37 °C до OD 600  = 0.40. Затем в питательную среду добавляли 0,2–0,5 мМ ИПТГ, продолжали культивирование еще 12 ч при 22 °С на ротационном шейкере с установкой скорости 150 об/мин. Клетки собирали и разрушали с помощью ультразвуковой обработки и очищали с помощью смолы His•Bind Ni-NTA или GST•Bind Resin (Novagen, Мэдисон, Висконсин) соответственно в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные белки подвергали диализу против PBS (фосфатно-солевой буфер) при 4 °C в течение ночи. Для получения высокоочищенных белков Tce1 и Tce1 S8A/A16E , меченных His, после очистки смолы His•Bind Ni-NTA были приняты дополнительные процессы.Элюированные образцы с Ni-NTA обессоливали буфером QA (20 мМ Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10% глицерина, pH 7,5) и загружали на HiTrap Q HP 1 мл с помощью хроматографической системы AKTA Pure 25 (GE Healthcare, США). . Для разделения образцов белка был выполнен градиент концентрации соли на 20 мл от 0,2 до 1 М NaCl. Белки Tce1 и Tce1 S8A/A16E , меченные His, элюировали примерно 0,35 М NaCl и объединяли. Рекомбинантные белки имели чистоту более 85%, проанализированную с помощью SDS-PAGE.

Для экспрессии и очистки белков внешней мембраны, E.coli BL21(DE3), который содержит соответствующий вектор экспрессии, выращивали в 5 мл LB при 37 °C и переносили в 500 мл LB до тех пор, пока OD 600 не достигала 0,4. Добавляли 0,3 мМ ИПТГ и доводили условия роста бактерий до 22 °С при встряхивании со скоростью 150 об/мин. Инкубированные клетки собирали и ресуспендировали в буфере для связывания (20 мМ Трис-HCl, 100 мМ глицина, рН 8,3) с 6 М мочевиной, а затем снова центрифугировали для удаления остаточных мембран. Супернатант очищали смолой His•Bind Ni-NTA и элюировали элюирующим буфером.Денатурированный белок смешивали с рефолдинговым буфером (55 мМ Tris-HCl, 0,21 мМ NaCl, 0,88 мМ KCl, 880 мМ L-аргинин, 0,5% SB-12, pH 7,0) в соотношении 1/20, затем при 4°C. ночная инкубация. Рефолдинговый белок подвергали ультрафильтрации для повышения его чистоты и концентрации, а затем подвергали диализу с буфером, содержащим 55 мМ Tris-HCl (pH 6,5), 0,21 мМ NaCl, 10 мМ L-аргинина и 0,5% SB-12 20 . Концентрации белка определяли методом Бредфорда с БСА (бычий сывороточный альбумин) в качестве стандарта.

GST pull-down assay

Для скрининга партнеров связывания Tce1 с GST pull-down 20,43 0,5 мг очищенного белка GST-Tce1 инкубировали со 100 мкл предварительно промытых глутатионовых гранул в течение 2 ч при 4 ° C, затем смешивали с очищенными клеточными лизатами, собранными из 100 мл культуры Yptb , и выдерживали еще 4 часа. После инкубации гранулы собирали и трижды промывали PBS, содержащим 300 мМ NaCl, и три раза PBS, содержащим 500 мМ NaCl. Белки, связывающиеся с гранулами, кипятили с буфером для образцов SDS, разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали с помощью окрашивания серебром (Bio-Rad).Отдельные белковые полосы на геле вырезали, расщепляли трипсином и анализировали с помощью матричной лазерной десорбции/ионизации/масс-спектрометрии (Voyager-DE STR, Applied Biosystems, Waltham, MA). Для анализа белковых взаимодействий очищенный слитый белок GST смешивали с 6×His слитым белком в PBS на ротаторе в течение 2 ч при 4°C, и использовали GST или нерелевантный белок CheY (BTH_II2365 в Burkholderia thailandensis ), слитый с GST. в качестве отрицательного контроля. После добавления 40 мкл предварительно промытой суспензии гранул глутатиона связывание продолжалось еще 2 часа при 4°С.Затем гранулы пять раз промывали буфером TEN (100 мМ Tris-Cl, 10 мМ EDTA, 500 мМ NaCl, pH 8,0). Оставшиеся белки разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали с помощью вестерн-блоттинга.

Бактериальный двухгибридный анализ

Для проведения бактериального двухгибридного анализа комплементации 44,45 производные pKT25 и pUT18C совместно трансформировали в E. coli BTh201 и культивировали на чашках MacConkey 9 2 2 мл (ампициллин 10 82 мл -1 , канамицин 50 мкг мл -1 , IPTG 1 мМ) при 30 °C.В то же время плазмиды pKT25-zip/pUT18C-zip и pKT25/pUT18C котрансформировали в E. coli BTh201, чтобы они служили в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Взаимодействия тестировали с использованием среды МакКонки, и красный цвет колоний свидетельствует о взаимодействии между белками, тогда как белый цвет колоний свидетельствует об отсутствии взаимодействия. Эффективность взаимодействия между различными белками количественно оценивали путем измерения активности β-галактозидазы в жидких культурах. Вкратце, ночные культуры разводили до 1% и выращивали в бульоне LB с антибиотиками при 30 °C до тех пор, пока OD 600 не достигала 1.0 и активность β-галактозидазы оценивали с использованием ONPG в качестве субстрата.

Анализ ингибирования роста

E. Coli BL21 (DE3) Harboring Pet28a Пустой вектор, Pet28a- TCE1 , PET28A- TCE1 S8A / A16E , а также Pet28a- TCI1 TCI1 TCI1 выращивали на среде LB. Ночные культуры доводили до того же значения OD 600 и разбавляли в 100 раз бульоном LB, содержащим соответствующие антибиотики. После инкубации при 26°С, 180 об/мин в течение 2 ч экспрессию рекомбинантных белков индуцировали добавлением 0.5 мМ IPTG и постоянно инкубировали в тех же условиях. Рост культур контролировали путем измерения OD 600 с интервалом в 2 часа.

Анализ белковой токсичности

Стационарные штаммы бактерий, выращенные в среде YLB, собирали, промывали и разводили в 40 раз в среде М9 и обрабатывали очищенными токсинами Tce1 и Tse1 (0,005, 0,01 или 0,1 мг мл –1 ) при 30 °С при встряхивании при 100 об/мин в течение 60 мин. После обработки культуры серийно разбавляли и высевали на чашки с агаром YLB, а колонии подсчитывали через 36 ч роста при 30°С.Процентную выживаемость рассчитывали путем деления количества КОЕ обработанных клеток на количество КОЕ клеток без обработки токсином. Все эти анализы были выполнены в трех экземплярах не менее трех раз.

Анализ секреции белка

Для проведения анализа секреции белка 46 , Штаммы Yptb выращивали в 3 мл YLB при 30 °C и переносили в 300 мл среды M9 с 1 мМ IPTG до достижения ОП 5,270. . Собирали два миллилитра культурального раствора и осадки клеток ресуспендировали в буфере для загрузки образца SDS-PAGE.Всего 280 мл культур центрифугировали при скорости 5000 об/мин в течение 20 мин, супернатант еще 50 мин центрифугировали при 9900 об/мин. Конечный супернатант собирали и фильтровали с помощью фильтра с размером пор 0,22 мкм (Millipore, MA). Все белки собирали трехкратной фильтрацией через нитроцеллюлозный фильтр (ВА85, Whatman, Германия). Фильтр растворяли в 100 мкл буфера для образцов SDS в течение 15 минут при 65 °C, а затем кипятили в течение 10 минут для восстановления присутствующего белка. Белковые образцы как общего клеточного осадка, так и культурального супернатанта разделяли с помощью SDS-PAGE и обнаруживали с помощью вестерн-блоттинга.Все образцы были нормализованы к OD 600 культуры и объему, использованному при приготовлении. Анализы секреции YPK_0952 проводили по аналогичной методике.

Вестерн-блот-анализ

Образцы белков разделяли с помощью SDS-PAGE и переносили на поливинилиденфторидные мембраны (Millipore, MA). Затем мембрану блокировали в 5% (вес/объем) БСА в течение 8 ч при 4°С и инкубировали с первичными антителами при 4°С в течение ночи: анти-VSVG (Santa Cruz biotechnology, каталожный №sc-365019, номер партии: B0916), 1:1000; анти-ICDH 47 , 1:6000; анти-РНКП (биотехнология Санта-Крус, номер по каталогу sc-56766, номер партии: F2514), 1:400; анти-His (биотехнология Санта-Крус, номер по каталогу sc-8036, номер партии: I1018), 1:500; анти-GST (биотехнология Санта-Крус, каталожный номер sc-53909, номер партии: F2413), 1:500; анти-β-лактамаза (Santa Cruz biotechnology, номер по каталогу sc-66062, номер партии: 8A5.A10), 1:1000. Мембрану пять раз промывали буфером TBST (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7,4), затем инкубировали с разбавленными 1:5000 вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Shanghai Genomics, номер по каталогу DY60203, номер партии: 20614) в течение 4 часов при 4 °C, и еще пять раз промывали TBST. буфер. Сигналы детектировали с помощью набора ECL plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ) с хемилюминесцентным имидж-сканером (Tanon 5200Multi, Beijing).

Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

Тотальную РНК выделяли из экспоненциально растущих штаммов с использованием набора RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit (TIANGEN, Пекин, Китай) вместе с набором ДНКазы I (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Германия).Концентрацию РНК измеряли с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Для измерения количества мРНК в каждом из образцов использовали TransStart Green qPCR Super-Mix (TransGen Biotech, Пекин, Китай) и систему обнаружения ПЦР в реальном времени Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкциями производителя. Праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 2. Для нормализации результатов в качестве внутреннего стандарта использовалось относительное содержание 16S рРНК.

Анализ ДНКазы

Очищенный белок Tce1 (0.016 мкМ) инкубировали с ДНК λ (0,35 мкг, Takara, Япония, № по каталогу 3010) в реакционном буфере (20 мМ MES, 100 мМ NaCl, 2 мМ CaCl 2 , 2 мМ MgCl 2 , pH 6, ). Всего в реакционную систему добавляли 4 мМ ЭДТА, 2 мМ другого двухвалентного металла или другого компонента, как указано в различных экспериментах. Реакцию гидролиза ДНК проводили при 37°С в течение 30 мин или указанных временных точек, и целостность ДНК анализировали с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле.

Анализ РНКазы

Суммарная РНК экстрагирована из E.coli TG1 и тРНК из E. coli MRE 600 (Roche, Германия, каталожный номер 10109541001) были приобретены у Sigma-Aldrich. Два микрограмма РНК инкубировали с различными концентрациями Tce1 в той же реакционной системе, что и для анализа ДНКазы, при 37°С в течение 30 мин. Целостность РНК определяли с помощью 2% агарозного геля.

Флуорофорное мечение белков

Флуорофорное мечение белков проводили, как описано 28 с небольшими изменениями. Остатки цистеина присутствовали на С-конце как Tce1, так и Tse1.Для подготовки белков к последующим реакциям мечения использовали 5 мМ ДТТ для восстановления потенциальных дисульфидных связей, образованных этими остатками цистеина, и реакции проводили при комнатной температуре в течение 2 часов. После восстановления дисульфидных связей ДТТ удаляют диализом в 20 мМ фосфата калия (рН 7,0) и 500 мМ NaCl. Реакции мечения проводили путем добавления 10 мМ малеимидных флуорофоров (Thermo Fisher Scientific, США, № по каталогу А10254), растворенных в диметилсульфоксиде, к восстановленному белку в молярном соотношении 5:1 (малеимид:белок) с последующей инкубацией при 4 °С. в темноте на ночь.Реакцию гасили добавлением 2 мМ ДТТ и диализовали в 2 л 20 мМ фосфата калия (рН 7,0) и 500 мМ NaCl в течение ночи при 4°С.

Флуоресцентное мечение живых бактерий

Флуоресцентное мечение живых штаммов бактерий проводили по описанной методике 28 с некоторыми модификациями. Вкратце, культуры с ОП 600  = 0,7 центрифугировали и ресуспендировали в М9-глюкозе, содержащей 1 мкМ белка, конъюгированного с флуорофором, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.Клетки пятикратно промывали для удаления свободной метки и ресуспендировали в объеме 100 мкл в М9-глюкозе. Десять микролитров клеточной суспензии наносили на 1% (масса/объем) агарозные подушечки на предметное стекло перед закрытием чистым покровным стеклом. Результат был получен с помощью высокоскоростного флуоресцентного конфокального микроскопа вращающегося диска (Andor Revolution-XD, Великобритания).

TUNEL (маркировка ник-конца терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP) и анализ методом проточной цитометрии

Ночная культура E.coli BL21(DE3), содержащие плазмиду pET28a или ее производные, экспрессирующие только Tce1 (pET28a- tce1 ) или вместе Tce1-Tci1 (pET28a- tce1 tci1 ), разводили в 100 раз в бульоне LB и инкубировали при 26 °C при встряхивании со скоростью 180 об/мин. После инкубации при 26°С в течение 2 ч экспрессию генов токсина и иммунитета индуцировали добавлением 0,5 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 4 ч при 26°С. Собранные клетки промывали PBS, фиксировали, инкубировали 5 мин в PBS с 0.3% Triton X-100 и окрашены с помощью набора для обнаружения клеточного апоптоза One-step TUNEL (Beyotime Biotechnology, Китай). При разрыве геномной ДНК открытые 3′-ОН могут быть помечены зеленым флуоресцентным зондом FITC, катализируемым терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT), которую можно обнаружить с помощью проточной цитометрии (Beckman, CytoFLEX). Десять тысяч клеток были собраны для каждого образца и проанализированы с помощью FlowJo_V10 48 .

Окрашивание DAPI и анализ методом проточной цитометрии

Для проведения окрашивания DAPI и анализа методом проточной цитометрии 49 , ночная культура E.coli BL21(DE3), содержащие плазмиду pET28a или ее производные, экспрессирующие только Tce1 (pET28a- tce1 ) или вместе Tce1-Tci1 (pET28a- tce1 tci1 ), разводили в 100 раз в бульоне LB и инкубировали при 26 °C при встряхивании со скоростью 180 об/мин. После инкубации при 26°С в течение 2 ч экспрессию генов токсина и иммунитета индуцировали добавлением 0,5 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 4 ч при 26°С. Собранные клетки промывали PBS, фиксировали, инкубировали 5 мин в PBS с 0.3% Triton X-100, окрашенный 10 мкг мл -1 DAPI в течение 30 мин при 37 °C (Solarbio, Китай), затем трижды отмыт PBS и обнаружен с помощью флуоресцентного микроскопа (Andor Revolution-XD, Великобритания) или проточного цитометрия (Beckman, CytoFLEX). Для каждого образца было собрано двадцать тысяч клеток, которые были проанализированы с помощью FlowJo_V10.

Субклеточное фракционирование

Для проведения субклеточного фракционирования 50 2 мл выращенной в течение ночи культуры Yptb (OD 600 1,0) собирали, промывали и инкубировали в 2 мл M9, содержащем 0.05 мг Tce1 при 30 °C в течение 60 мин. Бактериальные клетки, обработанные Tce1, промывали PBS для удаления внеклеточного белка Tce1 и инкубировали в 285 мкл сахарозного буфера (20 мМ PBS, pH 7,4, 20% сахарозы, 2,5 мМ ЭДТА) в течение 20 мин при комнатной температуре. После этого добавляли 285 мкл охлажденного льдом 0,5 мМ MgCl 2 и инкубировали в течение 5 минут при осторожном встряхивании. Суспензию центрифугировали при 7000 ×  g в течение 20 мин при 4 °C для сбора супернатанта, содержащего периплазматические белки (Peri). Осадок ресуспендировали в буфере для загрузки SDS и определяли как цитоплазматический (Cyto).Все образцы исследовали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.

Конструирование библиотеки мутантов с помощью epPCR

ПЦР с риском ошибок (epPCR) проводили на плазмиде pET28a- tce1 с использованием набора для случайного мутагенеза QuickMutation™ (Beyotime Biotechnology, Китай) с праймерами tce1 -F- HI и tce1 -R- Sal I в соответствии с инструкциями производителя. Программа эпПЦР была следующей: 94°С в течение 3 мин, 30 циклов по 30 с при 94°С, 30 с при 55°С и 30 с при 72°С, затем 10 мин при 72°С, окончательное удлинение.Продукты ПЦР очищали в геле, расщепляли с помощью Bam HI и Sal I и клонировали в расщепленную аналогичным образом pET28a. Смесь лигирования трансформировали в BL21(DE3). Трансформанты, утратившие токсичность, подвергали скринингу в среде LB, содержащей 0,5 мМ IPTG, и дополнительно подтверждали путем клонирования мутантных аллелей tce1 в новый вектор 51 . Мутации были идентифицированы анализом секвенирования ДНК.

Внутривидовая и межвидовая конкуренция in vitro

Для анализа внутривидовой конкуренции 24 выращенные в течение ночи штаммы промывали и доводили до OD 600 из 1.0 со средой M9 перед смешиванием для соревнований. Начальное соотношение донор-реципиент составляло 1:1, и кокультуры либо наносили пятном на нитроцеллюлозную мембрану 0,22 мкм (Nalgene), помещенную на чашки с агаром М9 при 26°С на 48 ч (для контактно-зависимой конкуренции), либо инокулировали в 2 мл среды М9 при 26 °C при встряхивании в течение 24 ч или 48 ч (для контактно-независимой конкуренции в жидкой среде). Для контактно-независимой конкуренции, проводимой на твердой поверхности, 5  мкл штамма-реципиента наносили на 0.Нитроцеллюлозная мембрана 22 мкм на чашках с агаром М9. После высыхания бактериального раствора на него надевали еще одну нитроцеллюлозную мембрану 0,22 мкм, на то же место второй мембраны наносили 5 мкл донорского штамма и инкубировали при 26°С в течение 48 ч. Штаммы донора и реципиента метили pKT100 (Km R ) или pACYC184 (Cm R ) соответственно для облегчения скрининга на чашках YLB. В указанные моменты времени после соревнования соотношение КОЕ штаммов донора и реципиента измеряли путем подсчета на чашках.Данные всех соревнований были проанализированы с использованием теста Стьюдента t , и показанные результаты представляют собой среднее значение одного репрезентативного анализа, проведенного в трех экземплярах.

Для анализа межвидовой конкуренции выращенные в течение ночи штаммы Yptb , несущие pKT100 (Km R ) и E. coli (DH5α) или S . Штаммы Typhimurium, содержащие pBBRMCS5-GFP (Gm R ) или pME6032 (Tet R ) (устойчивые к гентамицину или тетрациклину), трижды промывали средой M9 и доводили до OD 600  = 1.0. штаммов Yptb , разведенных в 10 раз, и аттенуированные в 100 раз целевые штаммы смешивали между собой в соотношении донор и реципиент 10 к 1 в жидкости М9, инкубировали при 26°С со скоростью 120 об/мин. После соревнования смеси серийно разбавляли, подсчитывали на чашках LB, содержащих соответствующие антибиотики, и определяли конечные КОЕ.

Инфицирование мышей и анализ конкуренции in vivo

Самок мышей BALB/c в возрасте 6 недель адаптировали в лаборатории в течение 3 дней и перорально вводили через зонд 10 9 КОЕ указанных штаммов Yptb , меченных pKT100 (Km R ) и мониторинг в течение 24 или 48 часов.По показаниям мышам вводили через зонд стрептомицин (100 мкл 200 мг мл раствора -1 ) за 24 часа до инфицирования Yptb . В конце эксперимента животных забивали, ткань слепой кишки и тонкой кишки измельчали, высевали на селективные планшеты YLB с антибиотиками для подсчета КОЕ.

Для анализа конкуренции между Yptb и E. coli в кишечнике мышей 6-недельным самкам мышей BALB/c перорально вводили через зонд стрептомицин (100 мкл 200 мг мл раствора -1 ) в день 1 .На 2-й день через зонд вводили 5 × 10 8 КОЕ E. coli DH5α, содержащих GFP, а на 3-й день 5 × 10 8 КОЕ штаммов Yptb вводили через зонд. Через 24 ч на 4-й день и 48 ч на 5-й день мышей умерщвляли, ткани слепой кишки и тонкого кишечника отделяли, серийно разбавляли, наносили на YLB (налидиксовая кислота, для отбора Yptb ) или LB (гентамицин, для отбора E. coli ) чашки для подсчета КОЕ.

Для анализа конкуренции между Yptb и S .Typhimurium из-за сложности обнаружения S . Typhimurium в тканях слепой кишки через 12 часов мышам, предварительно обработанным стрептомицином в течение 2 дней, перорально вводили через зонд смесь с равным количеством бактерий (5 × 10 8 КОЕ) Yptb и S . Typhimurium, содержащий pME6032. Через восемь часов мышей умерщвляли, ткани слепой кишки и тонкого кишечника отделяли, последовательно разбавляли и наносили на YLB (налидиксовая кислота, для отбора Yptb ) или XLT4 52 (тетрациклин, для отбора S .

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.