| 1 | 50 Оттенков Серого | Женские статусы и цитаты | 578 622 -16 Cтатистика | |
| 2 | Цитаты и статусы | 3 601 908 0 Cтатистика | |
| 3 | BEAUTYBOOK|Женские мысли|Статусы|Юмор | 139 873 +7 Cтатистика | |
| 4 | Кино Цитаты | 403 827 -80 Cтатистика | |
| 5 | английский в цитатах и мемах | 207 242 -20 Cтатистика | |
| 6 | Волчьи цитаты | Мемы про волков | 26 934 -19 Cтатистика | |
| 7 | NLO | 114 594 +836 Cтатистика | |
| 8 | t. A.T.u. | ТАТУ | TATU | 107 454 +10 Cтатистика | |
| 9 | Андрей Макаревич | 22 827 +7 Cтатистика | |
| 10 | Жизнь Волка и его друзей | Мемы | Цитаты | Ауф | 27 541 -19 Cтатистика | |
| 11 | Wowlol (вовлол) — сборник цитат и юмора из wow! | 49 003 -6 Cтатистика | |
| 12 | Цитаты из фильмов, сериалов и книг | 29 063 +2 Cтатистика | |
| 13 | Любимые Цитаты, фразы из книг, фильмов | 21 931 -1 Cтатистика | |
| 14 | All Right — женские цитаты и мысли | 95 358 0 Cтатистика | |
| 15 | Женское сердце — стихи•цитаты•мысли | 66 209 +9 Cтатистика | |
| 16 | Статусы цитаты | 2 777 445 0 Cтатистика | |
| 17 | Статусы. .. | 1 785 069 +5 Cтатистика | |
| 18 | Статусы | 977 231 +517 Cтатистика | |
| 19 | Статусы со смыслом | 1 881 908 +225 Cтатистика | |
| 20 | Крутые статусы | 1 895 182 -515 Cтатистика | |
| 21 | Статусы Со Смыслом | 1 196 494 +1 Cтатистика | |
| 22 | Статусы | 293 009 +161 Cтатистика | |
| 23 | Я не стерва, это нервы| Статусы | 2 501 921 +125 Cтатистика | |
| 24 | СТАТУСЫ ПРО ЛЮБОВЬ | 473 454 +136 Cтатистика | |
| 25 | Статусы. | 231 413 +112 Cтатистика | |
| 26 | Статусы для Пацана | 307 277 +39 Cтатистика | |
| 27 | Мне нравится Статусы | 1 476 043 +172 Cтатистика | |
| 28 | Цитаты, статусы о любви и жизни | 207 575 +83 Cтатистика | |
| 29 | Лучшие статусы. Цитаты. Стихи. | 320 424 Cтатистика | |
| 30 | Творчество | Статусы | На задворках реальности | 344 282 -9 Cтатистика | |
| 31 | Лучшие статусы и цитаты о любви. Про Любовь | 120 863 0 Cтатистика | |
| 32 | Статусы 2020 | 270 432 +1 Cтатистика | |
| 33 | Злая Зая | Статусы | 571 741 +95 Cтатистика | |
| 34 | От души | Пацанские статусы | 182 501 -6 Cтатистика | |
| 35 | Просто грустные статусы и цитаты… | 96 708 0 Cтатистика | |
| 36 | Красивые статусы про жизнь со смыслом в вк | 247 369 +11 Cтатистика | |
| 37 | Картинки и статусы про ЛЮБОВЬ | 109 493 +8 Cтатистика | |
| 38 | Статусы . ЗИМА | 370 702 -10 Cтатистика | |
| 39 | Красивые статусы | 108 944 +140 Cтатистика | |
| 40 | Статусы для вконтакте | 67 671 -1 Cтатистика | |
| 41 | Топ статусы / шрифты / обработка фотографий | 43 418 +53 Cтатистика | |
| 42 | Статусы со смыслом | 228 523 +149 Cтатистика | |
| 43 | Статусы красивым шрифтом | 34 184 +315 Cтатистика | |
| 44 | Статусы картинки | 75 203 +20 Cтатистика | |
| 45 | Статусы со смыслом про Любовь | 110 831 +4 Cтатистика | |
| 46 | Статусиღ | 66 877 -3 Cтатистика | |
| 47 | Хулиганка | Статусы | 180 011 +30 Cтатистика | |
| 48 | Статусы | Цитата | Мысли о тебе | 555 747 0 Cтатистика | |
| 49 | Статусы в контакте | 272 058 -5 Cтатистика | |
| 50 | СТАТУСЫ : Цитаты и Афоризмы | 62 058 +20 Cтатистика |
Федеральная служба по экологическому, технологическому и атомному надзору
16.
04.2021 Сибирское управление Ростехнадзора выявило 130 нарушений требований промышленной безопасности в ООО «Шахта «Есаульская»
Сибирское управление Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору (Ростехнадзор) в период с 5 по 16 апреля 2021 года провело плановую выездную проверку опасного производственного объекта «шахта угольная» I класса ООО «Шахта «Есаульская».
Читать далее → 16.04.2021 Центральное управление Ростехнадзора выявило нарушения при строительстве надземных пешеходных переходов на трассе М-10
Центральное управление Ростехнадзора в период с 25 января по 19 февраля 2021 года провело внеплановую выездную проверку строительства объекта «Расходы на мероприятия по повышению уровня обустройства автомобильных дорог федерального значения. Строительство надземных пешеходных переходов на км 180+328, км 189+425 автомобильной дороги М-10 «Россия» Москва – Тверь – Великий Новгород – Санкт-Петербург, Тверская область», ФКУ «Управление автомобильной магистрали Ордена Ленина «Москва – Санкт-Петербург Федерального дорожного агентства» (ФКУ УПРДОР «Россия»).
15.04.2021 Верхне-Донское управление Ростехнадзора приступило к расследованию причин аварии на Тамбовской ТЭЦ филиала ПАО «Квадра» — «Тамбовская генерация»
Обрушение 3 этажа здания главного щита управления Тамбовской ТЭЦ филиала ПАО «Квадра» — «Тамбовская генерация» (площадью около 500 кв. м) произошло 14 апреля 2021 года. По причине аварии полностью остановлено основное оборудование станции, объем снижения электрической мощности составил 85 МВт, тепловой мощности – 180 Гкал.
Читать далее → 15.04.2021 Нижне-Волжское управление Ростехнадзора выявило нарушения эксплуатации систем газораспределения и газопотребления в одной из школ Котовского района Волгоградской области
Нижне-Волжское управление Ростехнадзора в период с 5 по 9 апреля 2021 года провело плановую выездную проверку в отношении МКОУ «Моисеевская средняя школа» Котовского муниципального района Волгоградской области с целью контроля соблюдения соответствия мер, применяемых эксплуатационной организацией, требованиям Технического регламента «О безопасности систем газораспределения и газопотребления» на объекте технического регулировании — сети газопотребления предприятия.
15.04.2021 Сибирское управление Ростехнадзора выявило более 200 нарушений в ООО «Горэлектросеть»
Сибирское управление Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору (Ростехнадзор) 9 апреля 2021 года завершило внеплановую выездную проверку в отношении ООО «Горэлектросеть» (г. Новокузнецк).
Читать далее →Читать все новости →
Eckmannpsych vk
eckmannpsych vk Veja mais ideias sobre logo nasa, tipografia inspiração, logotipo tipografia. Jubilat is a slab serif typeface designed by Joshua Darden and released through Darden Studio in 2008. caitlinmurphy. 17 févr. ) ВСТАВИМ ТОЧКИ заказать взлом, проверка скрипта, скрипт для взлома, samp, игры, samsonas, samson, rec hd, как прочитать чужую переписку вк, взлом вконтакте 2021 Motter Ombra Normal Alts:Motter Ombra Motter Ombra 1. Among them, was the impossibly intricate Carlyle Roccoco. ru/profile/589226864904 Instagram: https://www.
21 août 2018 — Découvrez le tableau «@r$hi concept n design» de LauRe Kabuika sur Pinterest. VK (service), a Russian social network VK Mobile, a Korean mobile phone manufacturer; Akai VK, a portable helical scan EIA video VTR; Holden VK Commodore, a model of GM Holden’s Commodore car, produced from 1984 to 1986 VK is the largest European social network with more than 100 million active users. VK Architects & Engineers is a design and engineering firm with more than 65 years of experience and know-how. 647800 DEVELOPMENT 字体(字体家族名称:Eckmannpsych Variable Small;字体样式 See what vivian k (okay_vk) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. Voir plus d’idées sur le thème Architecture, Schémas d’architecture 10-mar-2021 — Explora el tablero de M I L A 🕊 «AESTHETIC 》» en Pinterest. Descubre lo que Pafro Norvo (pafronorvo) encontró en Pinterest, la colección de ideas más grande del mundo. futurefonts. Styles. Marguerite Marcella Mannix | Art Director, Photographer, Musician See what Birgitta (josephinebirgitta) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas.
Ver más ideas sobre disenos de unas, paletas de color topo, fotografía de chica graduación. See what Erik Lindberg (lindbergerik1) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. Jul 21, 2018 — Explore Zn Jn’s board «Edgy fonts» on Pinterest. . 000;PS 1. xyz/ohno/eckmannpsych. Eckmannpsych. Our goal is to keep old friends, ex-classmates, neighbors and colleagues in touch. Посмотрите больше идей на темы «каллиграфия, стили леттеринга, надписи». 2021 — Просмотрите доску «каллиграфия» пользователя Fingerscrosed в Pinterest. lib2. Apr 9, 2019 — Explore Alexandru Molnar’s board «Typeface design» on Pinterest. Download BLACK SUNSHINE BY KARINA HALLE – FREE EBOOKS DOWNLOAD Description: All Lenore Warwick wants for her 21st birthday is to hang out with her friends, finish her second year at Berkeley with flying colors, and maybe catch the eye of a hot musician playing a show at a club that she can now (legally) get into. . Jubilat. 10-mar-2021 — Explora el tablero de M I L A 🕊 «AESTHETIC 》» en Pinterest.
The optical sizes are great for prices. This site uses Akismet to reduce spam. 88;makeotf. САЙТ ИЗ ВИДЕО — www*vzlom-vk*eu5*net ВМЕСТО (*) — (. design/ See what Alice Evans (acevans1995) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. See what nat e (CPO3E06) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. 3-mar-2021 — Esplora la bacheca «calligraphy e graphic design» di Nahele su Pinterest. 2020 — Explore Miro Daddy’s board «papierové» on Pinterest. cheee Variable字体家族搜索结果，字客网为您分享cheee Variable资源，提供字体下载、字体上传、字体识别、字体转换、字体预览、字体生成、字体设计样张、字体资讯等服务。 Δείτε τι ανακάλυψε ο χρήστης Περτος (petrosstav666) στο Pinterest, τη μεγαλύτερη συλλογή ιδεών στον κόσμο. This geometric approach Hector Merienda | Hey! I’m a little beardy graphic designer from Valencia who loves sea ⚓, balloons, stamps & kraft paper, and adores birdhouses, bicycles & toy keys. Kinsey Designs | I help people in business for themselves understand their brand so that they magnetize what they desire into reality, like magic! 🔮😉 Descubre lo que Agus (agusmgarcia49) encontró en Pinterest, la colección de ideas más grande del mundo.
01. See what vivian k (okay_vk) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. See what Sophie Young (sophiemy04) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. Dan Hurst — Modern Verse Design | I live in a wee little house with my beautiful wife Angela and my little dog Marmite. 0 Wed Jun 24 23:09:14 1998 Motter-Ombra. 7k Followers, 355 Following, 4276 pins See what kamry v (trashcanbaby) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. 82 — 2,314 VK. 5/jan/2021 — Explore a pasta «Design Tipografia» de Bel Andrade Lima, seguida por 74731 pessoas no Pinterest. 2020 — I was commissioned by Adobe to create a three pieces project to test the Illustrator on iPad. Draw a dream and make VK may refer to: . See more ideas about lettering fonts, numbers font, typography fonts. 10 Following. 260 likes · 1 talking about this. VK. ART EN GREVE est composé·e de travailleur·ses de l’art et de collectifs engagé·es dans les luttes sociales et politiques, rassemblé·es pour converger et construire collectivement une alternative anti-capitaliste, solidaire & intersectionelles.
Salsbury, Zero F*cks by L. K. @veekhongkam. Caitlin Murphy | https://www. The result is a typeface that recalls cooled lava flows drawn with a compass. Découvrez vos propres épingles sur Pinterest et enregistrez-les. Taking a look at the (fatface) genre, I was seeing mostly the same things [over and over]: №1 an inability to treat problematic letters effectively, & №2 a consistently traditional structure. See more ideas about lettering fonts, lettering, edgy fonts. Visualizza altre idee su grafici, tendenze di progetti grafici, grafici in movimento. — 2. 4 (Vampire Knight, #4) by. The latest broadcasts from VK (@veekhongkam). 01. 107 Followers. … 15-mei-2017 — Deze pin is ontdekt door Alexey Kalinin. 2020 — Cette épingle a été découverte par choi jun su. —————— English ———————— Pilowlava (sic) was born as an intuitive, fast-paced creative feedback loop in which its creators tried to surprise one another. “A human being should be able to change a diaper, plan an invasion, butcher a hog, conn a ship, design a building, write a sonnet, balance accounts, build a wall, set a bone, comfort the dying, take orders, give orders, cooperate, act alone, solve equations, analyze a new problem, pitch manure, program a computer, cook a tasty meal, fight efficiently, die Epub Vk Books Showing 1-43 of 43 Everything All at Once (Kindle Edition) by.
Aseel Bankhar | I am a freelance graphic designer who is passionate about design. Beauty, Cosmetic & Personal Care See what NANA (obvilionn) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. Ontdek (en bewaar!) je eigen pins op Pinterest. Fairly straightforward. See more ideas about typography, typography design, lettering. Ver más ideas sobre disenos de unas, paletas de color topo, fotografía de chica graduación. Julia Breuer | Fashion & Management graduate at the Amsterdam Fashion Institute | MARKETING | FASHION | EVENTS | Project management Oct 13, 2018 — I’m so f***ing tired of Helvetica — Editorial | Andrea Bianchi 04. com/club192980141 Ok: https://ok. 4th February Designers: Sergiy S. 9. 0 Broadcasts. Monique Aimee is an illustrator and lettering artist with a passion for drawing strong women, travel, and food. 5. Matsuri Hino (shelved 4 times as vk) avg rating 4. Whyte is a sans-serif type family designed by Johannes Breyer, Fabian Harb and Erkin Karamemet.
B. 2019 — Découvrez le tableau «Calligraphie» de Fonzi Da sur Pinterest. 6 janv. Uncategorised meerkat pop up gif Ashley Tomlinson | designer | bibliophile | wearing black | dog person | food enthusiast | she/her Nov 26, 2020 — Explore Yaw’s board «Design» on Pinterest. It doesn’t seem to be used as much on the web as other slab serifs such as Adelle which is a shame because it’s a great typeface. I try to replicate my style with the tools additional allowed on the app. Alles hat ein Ende, nur die Wurst hat zwei. Vk: https://vk. Energy Therapy for Animals is designed to create a deep relaxation response which is primary to normal functioning of the body’s various systems. Najwa Iskandar | do better See what Balie Mara (baliemara) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. ¶ I was convinced a fatface could be more chill, and so Ohno Blazeface was born. I believe that design is a message and it can be a tool to change the world. Katrina Leno (Goodreads Author) (shelved 1 time as epub-vk) avg rating 3.
https://www. Jan 11, 2021 — Explore vivian k’s board «typography» on Pinterest. Small Medium Large. Additional option is to add VK messages widget on your website, so VK users don’t have to write you email or leave your website — they can write you a message through VK chat. 7,076. 0. A psychedelic version of Eckmannschrift by Otto Eckmann. 30 — 15,300 ratings — published Whyte. 135 Followers, 146 Following, 1581 pins — See what Marieke Bremer (mariekebremer) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. I work as a designer of many disciplines within the clothing industry. Collins, and The Vk Books Showing 1-50 of 1,857 Vampire Knight, Vol. Tkachenko Typefaces: Laqonic 4F Unicase‚ Cubynets 4F‚ Dart 4F‚ Kent 4F‚ Meeneralca 4F Unicase Bold‚ Robotesqa 4F‚ Model 4F Unicase‚ Condesqa 4F‚ Zantiqa 4F‚ Vanyla 4F‚ Targo‚ Cedra‚ Akzentica‚ Ukraintica‚ Waldemar‚ Kylie‚ Republica‚ Ola Script‚ Boldesqo Serif‚ Clarenta Black‚ ukrantica‚ Rodequa Slab‚ Perfopunto Aug 3, 2019 — Explore Ujiyanto’s board «campur» on Pinterest.
vk has 666 books on Goodreads. com/rickman4783/ Ohno Blazeface is a “real” fat fatty of a display serif. 13 подписчик. Striving to please both of its parents, Pilowlava seeks a balance between viscous energy and controlled geometry. Voir plus d’idées sur le thème calligraphie, police d’écriture, lettrage. As a multi-professional and interdisciplinary company, we offer a wide range of services within the design process. See more ideas about lettering, lettering fonts, typeface. Learn how your comment data is processed. Anna Morozova. Draw a dream and make it real. See more ideas about design, graphic design, graphic design inspiration. instagram. See what kamry v (trashcanbaby) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. Mar 29, 2021 — Explore Suppachok Thepkaew’s board «Graphic Design» on Pinterest. Eckmannpsych Variable Small Version 1. ВКонтакте – универсальное средство для общения и поиска друзей и одноклассников, которым ежедневно пользуются десятки миллионов человек.
While working for Photolettering in the seventies, Paul Carlyle designed many famously ornate typefaces. See what Andy Med (andymedi) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. 0;hotconv 1. pintar letras de graffitis 135 Followers, 146 Following, 1581 pins — See what Marieke Bremer (mariekebremer) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. See what Dan Angelo AGuardian (danguardian) has discovered on Pinterest, the world’s biggest collection of ideas. 5 подпис. Books shelved as vk-romance-books: Forbidden by Lauren Smith, Beautiful by Christina Lauren, Split by J. See more ideas about Le creuset, Vlastnoručne robené doplnky, Papierové ozdoby. See more ideas about design, graphic design inspiration, graphic design. VK users often ask about prices and delivery conditions without reading the information on your fanpage or products section, so be ready. Spent so long on this ® that I had to VK is the largest European social network with more than 100 million active users.
10. 18. com/idrickman16 Group vk: https://vk. Our goal is to keep old friends, ex-classmates, neighbors and colleagues in touch. Our architects and engineers design buildings and spaces where people can heal, enjoy education, work or relax. It was published through Swiss foundry Dinamo in 2019. The project allowed me to be part of the Illustrator on iPad beta team, testing the app. eckmannpsych vk
Сигнальный путь с участием дигуанилатциклазы CelR и регулятора ответа DivK контролирует синтез целлюлозы в Agrobacterium tumefaciens
РЕФЕРАТ
Производство фибрилл целлюлозы связано с прикреплением Agrobacterium tumefaciens к растению-хозяину. В соответствии с предыдущими исследованиями, мы недавно сообщили, что предполагаемая дигуанилатциклаза, celR , необходима для синтеза этого полимера в A. tumefaciens. В этом исследовании изучались эффекты celR и других компонентов регулирующего пути производства целлюлозы.
Мутационный анализ celR продемонстрировал, что циклаза требует каталитического мотива GGEEF, а также консервативного аспартатного остатка CheY-подобного принимающего домена для стимуляции продукции целлюлозы. Более того, сайт-направленная мутация в домене PilZ CelA, каталитической субъединице целлюлозосинтазного комплекса, значительно снижает выработку целлюлозы. Кроме того, делеция divK , первого гена оперона divK-celR , также снижает выработку целлюлозы.Эта потребность в divK была облегчена за счет экспрессии конститутивно активной формы CelR, что позволяет предположить, что DivK действует выше активации CelR. Основываясь на бактериальных двухгибридных анализах, CelR гомодимеризуется, но не взаимодействует с DivK. Мутация в divK дополнительно влияла на морфологию клеток, и этот эффект дополнялся копией гена дикого типа, но не конститутивно активным аллелем celR . Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что CelR является истинной c-ди-GMP-синтазой и что нуклеотидный сигнал, продуцируемый этим ферментом, активирует CelA через домен PilZ.
Наши исследования также предполагают, что сигнальный путь DivK / CelR в Agrobacterium регулирует выработку целлюлозы независимо от систем контрольных точек клеточного цикла, которые контролируются divK .
ВВЕДЕНИЕ
Взаимодействие растительного патогена Agrobacterium tumefaciens с его хозяином зависит от прикрепления (1, 2), что требует производства якорных факторов. Одним из компонентов матрицы прикрепления, продуцируемой бактерией, является целлюлоза, β1,4-связанный полимер глюкозы.Фибриллы целлюлозы служат для прикрепления бактерий друг к другу и стабилизации взаимодействия бактерий с клетками растений (3). Мутанты, не продуцирующие целлюлозу, менее прочно связываются с поверхностями растительных клеток (4, 5) и, кроме того, не формируют биопленки эффективно (6).
Производство целлюлозы штаммом C58 A. tumefaciens кодируется двумя тесно связанными оперонами, celABC и celDE , расположенными на линейной хромосоме (7–9). Два гена, celA и celB , кодируют гетеродимерный комплекс целлюлозосинтазы (10).
Белки CelD и CelE, вероятно, ответственны за синтез UDP-глюкозы, процесс, который включает промежуточное соединение липид-глюкоза (10). Комплекс CelA-CelB затем катализирует добавление активированной глюкозы к расширяющемуся целлюлозному волокну (11, 12). На основании данных, полученных на других бактериях, фибриллы целлюлозы вытесняются во внеклеточную среду из синтазного комплекса, возможно, с помощью экспортера, кодируемого CelC, встроенного в мембрану клеток (13, 14).
Синтез целлюлозы в A.tumefaciens напоминает производство этого полимера в модельной бактерии Gluconoacetobacter xylinum (15). В этой системе комплекс синтазы, кодируемый bcsA и bcsB , отвечает на вторичную сигнальную молекулу циклического дигуанозинмонофосфата (c-di-GMP) (16, 17), при этом субъединица BcsA распознает нуклеотид через PilZ domain, один из нескольких известных c-di-GMP-связывающих доменов (18–20). Последовательности CelA и BcsA строго консервативны, включая С-концевой домен PilZ.
В соответствии с этим консервативным сигнально-связывающим доменом Amikam и Benziman (21) сообщили, что в клеточных экстрактах A. tumefaciens добавление c-di-GMP существенно увеличивает скорость синтеза целлюлозы. Эти наблюдения убедительно свидетельствуют о том, что синтез целлюлозы в A. tumefaciens частично регулируется c-di-GMP.
В предыдущих исследованиях мы сообщали, что производство целлюлозы в A. tumefaciens стимулируется предполагаемой дигуанилатциклазой (DGC), которую мы назвали CelR (22). Сверхэкспрессия celR привела к увеличению продукции полимера, в то время как удаление гена значительно снизило количество целлюлозы, экстрагируемой из клеток (22).Эти результаты предполагают, что celR участвует в активации синтеза целлюлозы. Ген celR является частью оперона divK-celR , который строго консервативен у многих альфа-протеобактерий (см. Рис. S1 в дополнительном материале) (22). Интересно, что у Caulobacter crescentus этот оперон, обозначенный как divK и pleD , контролирует события на полюсах клетки.
PleD, ортолог CelR, участвует в регуляции образования удерживающей ножки, тогда как DivK локализует регуляторы клеточного цикла, включая факторы для активации PleD, на специфических полюсах клетки во время деления (23-27).Ген divK также контролирует полярную локализацию во время клеточного цикла Brucella abortus (28), а у Agrobacterium divK функционирует в фосфорелейном каскаде, который регулирует деление клеток (29). Эти наблюдения предполагают, что оперон divK-celR ( pleD ) и составляющие его гены могут играть разные роли среди различных видов альфа-протеобактерий.
Хотя мы продемонстрировали, что celR влияет на производство целлюлозы в A.tumefaciens, механизм, с помощью которого это происходит, до сих пор неизвестен. На основании биохимического и мутационного анализов PleD C. crescentus обладает активностью дигуанилатциклазы (25, 30, 31). Однако есть ограниченные доказательства того, что CelR, хотя и содержит консервативный мотив синтеза c-di-GMP, является функциональным DGC (22, 29).
Существует несколько примеров белков с доменами GGDEF, которые не проявляют активность синтеза c-di-GMP (см. Ссылки 32 и 33). Таким образом, возможно, что celR стимулирует синтез целлюлозы каким-то альтернативным механизмом.
В этом исследовании мы изучили влияние целевых мутаций в divK и celR на синтез целлюлозы у A. tumefaciens. Наши результаты показывают, что для активности CelR необходим интактный мотив GGEEF, а также консервативный остаток аспартата в первом из двух CheY доменов белка. В свою очередь, мутация замены в остатке, связанном со связыванием c-di-GMP в домене PilZ CelA, значительно снижает количество целлюлозы, синтезируемой мутантом.Мы также показываем, что стимуляция биосинтеза целлюлозы с помощью CelR зависит от DivK. Однако divK также влияет на деление клеток A. tumefaciens, и это влияние не зависит от celR . Наши результаты согласуются с представлением о том, что divK продолжает регулировать деление клеток у A.
tumefaciens, как и у других альфа-протеобактерий, в то время как оперон divK-celR отклонился, чтобы также регулировать выработку целлюлозы среди членов семейства Rhizobiaceae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерий, культивирование и условия роста. Штаммы бактерий, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Штаммы Escherichia coli выращивали на чашках с агаром Luria-Bertani (LB) (Invitrogen) с соответствующими антибиотиками при температуре 37 ° С. Штаммы Agrobacterium tumefaciens выращивали на питательном агаре (NA) (Fisher) или на чашках с минимальной средой AB (34) с добавлением 0,2% маннита (ABM) с соответствующими антибиотиками при 28 ° C. Культуры E. coli выращивали в бульоне LB с необходимыми антибиотиками при 37 ° C при встряхивании.Культуры A. tumefaciens выращивали на среде MG / L (35) с соответствующими антибиотиками при 28 ° C при встряхивании. Используемые антибиотики включают ампициллин (100 мкг / мл для E. coli), карбенициллин (50 мкг / мл для A.
tumefaciens), канамицин (50 мкг / мл для E. coli и A. tumefaciens), гентамицин (50 мкг / мл. для E. coli и 25 мкг / мл для A. tumefaciens) и тетрациклина (10 мкг / мл для E. coli и A. tumefaciens). При необходимости, Конго красный (50 мкг / мл), изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (IPTG) (400 мМ) или 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-галактопиранозид (X-Gal) ( 80 мкг / мл) добавляли в планшеты для оценки фенотипа.
Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании a
Конструирование штамма. Праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, перечислены в таблице 2.
(i) Конструирование штаммов со сверхэкспрессией. Геномная ДНК была получена из ночная культура A. tumefaciens NTL7, как описано ранее (36). Для создания плазмиды сверхэкспрессии pKK38 celR ген celR амплифицировали с помощью ПЦР с использованием полимеразы Pfu (Stratagene) и праймеров celR -fnco и celR -r.
Ампликон расщепляли BamHI и лигировали с расщепленной BamHI pUC18. Полученные продукты лигирования вводили в E. coli DH5α трансформацией CaCl 2 с селекцией на чашках LB, содержащих ампициллин. Плазмиды очищали, и полученный фрагмент лигировали с расщепленной NcoI и BamHI pKK38ASH (таблица 1) и трансформировали в штамм DH5α. После отбора на устойчивость к тетрациклину плазмиду выделяли и анализировали, и правильную конструкцию электропорировали в соответствующие штаммы A.tumefaciens. Для экспрессии celA с контролируемого промотора ген амплифицировали с помощью ПЦР с использованием полимеразы Pfu и праймеров celA -f и celA -r. Продукт ПЦР расщепляли BamHI и лигировали в pUC18, расщепленную BamHI, и полученные продукты лигирования трансформировали в штамм DH5α. Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, плазмиды очищали и расщепляли NdeI и BamHI. Полученный фрагмент celA лигировали в вектор экспрессии pSRK-Gm (таблица 1) и трансформировали в DH5α.
После отбора на устойчивость к гентамицину плазмиду выделяли и анализировали, и правильную конструкцию электропорировали в соответствующие штаммы A. tumefaciens.
(ii) Получение векторов вставки Tn 7 . Сегмент длиной 400 п.н., содержащий промоторную область оперона divK-celR вместе с дополнительной ДНК, кодирующей либо divK , либо divK-celR , амплифицировали с использованием . Полимераза Pfu и праймеры pr divKcelR -f и divK -r или праймеры pr divKcelR -f и celR -r.Ампликоны переваривали и клонировали в pUC18, расщепленную BamHI. Полученные продукты лигирования трансформировали в E.coli DH5α, трансформанты выделяли на чашках LB, содержащих ампициллин, и рекомбинантные плазмиды очищали и подтверждали анализом последовательности. Правильные клоны переваривали BamHI, и фрагменты лигировали в pUC18-miniTn 7 t-Gm с образованием pUCTn 7 -pr divK и pUCTn 7 -pr divKcelR .
Полученные плазмиды трансформировали в штамм DH5α, отбирали по устойчивости к ампициллину и гентамицину, очищали и тестировали на подходящую вставку с помощью анализа рестрикционного переваривания.
(iii) Сайт-направленный мутагенез. Целевые фрагменты, клонированные в pUC18, pUC-miniTn 7 t-Gm / Km или pSRK-Gm, амплифицировали методом ПЦР с использованием полимеразы Pfu с праймерами, содержащими точечные мутации в мишени остаток (таблица 2). Полученные в результате амплифицированные плазмиды обрабатывали DpnI для удаления исходной матричной ДНК, а оставшиеся плазмиды трансформировали в E. coli DH5α. После отбора на устойчивость к соответствующему антибиотику плазмиды выделяли, и мутации подтверждали анализом последовательности.Измененные плазмиды вводили в соответствующие штаммы электропорацией или вставкой Tn 7 , как описано ниже. Фрагменты, содержащие правильную мутацию в pUC18, выделяли путем переваривания соответствующими рестрикционными ферментами и затем лигирования либо в pZLQ (Таблица 1), либо в pKK38ASH.
(iv) Нарушение хромосомного гена celA . Неполярная делеция celA ( atu3309 ) была сконструирована следующим образом. Внутренний фрагмент celA длиной 500 п.н. амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК A.tumefaciens NTL7 с использованием ДНК-полимеразы Pfu и праймеров celA / Eco и celA / Xb. Полученный ампликон переваривали EcoRI и XbaI и клонировали между соответствующими сайтами на pVIK112 (37). Полученные продукты лигирования трансформировали в E. coli S17-1 / λ pir с отбором на устойчивость к канамицину. Полученная плазмида pVIK celA была идентифицирована и трансформирована в штамм NTL7 путем электропорации. NTL7, несущий разрушение celA в результате события однократного кроссовера, был выбран путем посева на среду, содержащую соответствующие антибиотики.Нарушение инсерции celA было подтверждено с помощью ПЦР с использованием дополнительных праймеров, расположенных выше и ниже исходных фрагментов.
Полученный мутант создает транскрипционное слияние celA :: lacZ .
(v) Удаление celR путем аллельного обмена в мутанте celA . Ген celR был удален из A. tumefaciens NTL7Δ celA :: lacZ , как описано ранее Barnhart et al. (22).
(vi) Indel-мутация divK . Ген divK был заменен кассетой устойчивости к канамицину с использованием протокола, модифицированного по сравнению с протоколом Даценко и Ваннера (38). Вкратце, набор праймеров, divK frt-f (frt означает мишень рекомбинации FLP) и divK frt-r использовали для амплификации кассеты канамицина из pKD4 (таблица 1) с помощью ПЦР, и продукт обрабатывали Дпни тупить концы. Кроме того, фрагмент размером 3,9 т.п.н., содержащий divK , был амплифицирован из A.tumefaciens NTL7 с использованием праймеров divK region-f и divK region-r. Фрагмент расщепляли с помощью KpnI и клонировали в pRK415 (таблица 1), создавая конструкцию pRK в области divK .
Конструкцию вводили в E.coli DH5α трансформацией CaCl 2 , и плазмиду очищали и подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием. Сгенерированный с помощью ПЦР фрагмент канамицина электропорировали в штамм E. coli, несущий плазмиду рекомбиназы red pKD46 (таблица 1) и плазмиду области pRK divK , трансформанты отбирали на устойчивость к канамицину, плазмиды очищали и исследовали. для замены divK на pRK415 с помощью рестрикционного анализа и ПЦР.Правильные плазмиды, содержащие замененный ген, обрабатывали KpnI, модифицированный ген divK клонировали в pir -зависимый вектор pWM91 (таблица 1), получая конструкцию pWM divK kan, и эту плазмиду трансформировали в E coli S17-1 / λ pir . Были отобраны успешные конструкции на предмет устойчивости к ампициллину и канамицину, и проверенная плазмида была электропорирована в A. tumefaciens. Исходные трансформанты были отобраны на предмет устойчивости к канамицину и сахарозе с последующим скринингом на чувствительность к карбенициллину.
Потенциальные мутанты были подтверждены с помощью ПЦР и саузерн-анализа.
(vii) Аллельный обмен divK-celR . Оперон divK-celR был удален с использованием другой модификации протокола, предложенной Даценко и Ваннером (38). Набор праймеров, divK, frt-f и celR frt-r, использовали для амплификации кассеты канамицина из pKD4 с помощью ПЦР, и продукт обрабатывали DpnI для притупления концов. Кроме того, фрагмент размером 4,2 т.п.н., содержащий divK и celR , был амплифицирован из A.tumefaciens NTL7 с использованием праймеров divK region-f и celR region-r. Фрагмент расщепляли KpnI и клонировали в pRK415, создавая конструкцию pRK в области divKcelR . Конструкцию вводили в E. coli DH5α трансформацией CaCl 2 , и плазмиду очищали и проверяли рестрикционным расщеплением и секвенированием. Фрагмент, содержащий кассету канамицина, электропорировали в штамм E. coli, несущий плазмиду рекомбиназы red pKD46 и pRK divKcelR , трансформанты отбирали на устойчивость к канамицину, плазмиды очищали и исследовали на предмет замены оперона на кассету с канамицином рестрикционным расщеплением и ПЦР.
Правильную плазмиду, содержащую замененный оперон, переименованную в pRK divKcelR kan, электропорировали в штамм E. coli, содержащий плазмиду pCP20, которая экспрессирует ген рекомбиназы flp . Конструкцию, в которой была удалена кассета канамицина, идентифицировали путем скрининга на устойчивость к тетрациклину, но на чувствительность к канамицину, и плазмиды очищали и исследовали на потерю кассеты канамицина рестрикционным расщеплением. Правильные плазмиды переваривали KpnI, модифицированную область клонировали в pWM91, получая конструкцию pWM divKcelR del, и эту плазмиду трансформировали в E.coli S17-1 / λ pir . Были отобраны успешные конструкции на предмет устойчивости к ампициллину, и проверенная плазмида была электропорирована в A. tumefaciens. Исходные трансформанты были отобраны по устойчивости к ампициллину для единичных событий рекомбинации с последующим выращиванием в среде MG / L и скринингом на устойчивость к сахарозе и чувствительность к карбенициллину.
Потенциальные мутанты с обменом маркеров были подтверждены с помощью ПЦР и саузерн-анализа.
(viii) Комплементация штаммов NTL7Δ celR :: Gm, NTL7Δ divK :: Km и NTL7Δ divKcelR .Чтобы дополнить разрывы divK и celR , соответствующие конструкции Tn 7 , а также плазмиду транспозазы pTNS2 (таблица 1) были электропорированы в целевой мутант при соотношении 1: 2 вектора Tn 7 к вектору . pTNS2. Трансформированные клетки отбирали по устойчивости к гентамицину, и интегранты mini-Tn 7 были подтверждены ПЦР-анализом с использованием праймеров Tn7insert-L и либо pTn7-L, divK -r, либо celR -r.
(ix) Двухгибридные конструкции.Гены divK и celR были амплифицированы из геномной ДНК штамма NTL7 A. tumefaciens с использованием полимеразы Pfu и праймеров, специфичных для вставки в двугибридные векторы экспрессии. Соответствующие аллели divK и celR были амплифицированы из их рекомбинантных плазмид с использованием полимеразы Pfu и указанных выше праймеров.
Фрагменты divK расщепляли XhoI и KpnI, а фрагменты celR расщепляли BamHI и KpnI.Фрагмент, кодирующий divK , лигировали в pSR658, трансформировали в E.coli DH5α и отбирали для среды, содержащей тетрациклин. Фрагмент, кодирующий celR , лигировали в pSR659, трансформировали в штамм DH5α и отбирали для среды, содержащей ампициллин. Плазмиды выделяли, очищали и проверяли на правильность вставки рестрикционным расщеплением и секвенированием. Плазмиды, содержащие правильную вставку, трансформировали либо в штамм E. coli SU101, либо в SU202, и отбирали их по устойчивости к канамицину и тетрациклину или ампициллину.
Двухгибридные анализы E. coli. Бактериальные двугибридные анализы выполняли, как описано ранее (39). Штамм E. coli SU101, содержащий плазмиды с аллелями celR-lexA или штамм SU202, содержащий плазмиды с аллелями divK и celR , слитых с ДНК-связывающим фрагментом lexA , высевали на среду LB, содержащую соответствующие антибиотики.
, IPTG и X-Gal. Планшеты инкубировали при 28 ° C в течение 3 дней, чтобы определить, подавлен ли ген lacZ тестируемого штамма.Взаимодействие между гибридными белками приводит к образованию светло-голубых колоний из-за репрессии lacZ , управляемой промотором, регулируемым LexA (39). Все эксперименты повторяли не менее трех раз с отрицательными контролями родительских штаммов, несущих пустой вектор pSR658 или pSR659, и родительскими штаммами, несущими плазмиду положительного контроля pMS604 или pDP804 (40), каждый из которых содержал lexA полной длины.
Анализ целлюлозы. Целлюлозу определяли количественно после экстракции с использованием протокола Updegraff (41), модифицированного Barnhart et al.(22). Количество антрон-реактивного материала, экстрагируемого из образца, стандартизировали по количеству клеток, определенному путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD 600 ). cel мутанты штамма NTL7 A. tumefaciens все еще продуцируют антрон-положительный материал, вероятно курдлан (22). По этой причине среднее количество экстрагируемой целлюлозы на 10 9 клеток было затем нормализовано путем вычитания количества антрон-положительного материала, экстрагированного из A. tumefaciens NTL7Δ cel или NTL7Δ celA :: lacZ , в зависимости от на эксперименте все, как мы описали ранее (22).Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t с использованием модели одностороннего распределения.
Анализ β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы определяли количественно с использованием микротитровального анализа, как описано Slauch и Silhavy (42). Клетки, выращенные в течение ночи при 28 ° C в среде MG / L с соответствующими антибиотиками, субкультивировали в 2 мл среды ABM, выращивали в течение 24 часов до середины экспоненциальной фазы, собирали центрифугированием и ресуспендировали в 1,5 мл Z-буфера, pH 7,1. (42). Объемы 250 мкл каждой суспензии были удалены для измерения мутности при 600 нм.К оставшимся объемам добавляли пятнадцать микролитров 1% SDS и 30 мкл хлороформа, образцы встряхивали в течение 10 с и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре, и 60 мкл лизатов распределяли в лунки для микротитрования полистирола (Corning ). Конечный объем в каждой лунке доводили до 200 мкл Z-буфером. Реакцию инициировали добавлением 50 мкл o -нитрофенил-3-d-галактопиранозида (ONPG) (10 мг / мл) в Z-буфере без добавления 3-меркаптоэтанола, и поглощение при 420 нм контролировали в Кембриджском университете. Микропланшетный ридер биотехнологической модели 700.Показания снимали с 3-минутными интервалами в течение 24 минут. Активность β-галактозидазы рассчитывали, как описано ранее (42). Каждый штамм был проанализирован девять раз, и скорости реакции были усреднены и статистически проанализированы с использованием теста Стьюдента t с односторонней моделью распределения.
Микроскопия. Клетки выращивали в среде MG / L с соответствующими антибиотиками в течение ночи при 28 ° C при встряхивании. Клетки из каждой культуры, выросшие до одинаковой OD 600 , исследовали с помощью фазово-контрастной микроскопии с использованием исследовательского микроскопа Olympus BH-2 (Olympus) с цифровой камерой Olympus Camedia (Olympus).Для каждого образца записывали два поля изображения, и в каждом поле подсчитывали общее количество клеток и количество деформированных клеток. Процент деформированных клеток был рассчитан из двух повторений (всего четыре поля), со статистическим анализом, выполненным с использованием теста Стьюдента t с односторонней моделью распределения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменение ключевых остатков влияет на влияние CelR на производство целлюлозы. Ранее мы показали, что celR требуется для стимуляции биосинтеза целлюлозы (22).Биоинформатический анализ этого белка выявил два N-концевых CheY-подобных приемных домена, первый из которых содержит консервативный остаток аспартата, а также C-концевой каталитический мотив GGEEF, связанный с синтезом c-di-GMP (см. Рис. S1 в дополнительный материал). Белки с доменами CheY часто переходят между активированной и неактивной формами в зависимости от состояния фосфорилирования консервативного остатка аспартата (25, 43, 44). Учитывая его доменную структуру, эти наблюдения предполагают, что CelR является c-ди-GMP-синтазой и что ее активность модулируется модификацией остатка Asp в домене CheY.
В серии предварительных экспериментов мы сверхэкспрессировали celR , мутированное по Asp53 в домене CheY ( celR D53A) или по ключевому остатку ферментативного мотива GGEEF ( celR E373A) в штамме дикого типа NTL7. Мы оценивали влияние этих мутаций на производство целлюлозы по цвету колоний на чашках с красным конго (45) и по свойствам роста в жидких средах. Как мы описали ранее (22), по сравнению с родительским, сверхэкспрессия celR дикого типа приводила к усилению связывания конго красного (рис.1А), а также выраженная агрегация в жидких средах (рис. 1Б). A. tumefaciens NTL7, сверхэкспрессирующий либо celR D53A, либо celR E373A, продемонстрировал небольшое изменение связывания Конго красного (фиг. 1A) и практически не показал наблюдаемой агрегации во время роста в жидкой среде (фиг. 1B). В количественных анализах штамм NTL7, сверхэкспрессирующий celR , продуцировал значительно более высокий уровень экстрагируемой целлюлозы, чем продуцируемый родительским штаммом (фиг. 2A). Напротив, сверхэкспрессия celR D53A или celR E373A не оказывала значительного влияния на количество продуцируемого полимера (рис.2А). Эти результаты предполагают, что для стимуляции синтеза целлюлозы CelR требует интактного мотива GGEEF и консервативного остатка аспартата в домене CheY.
FIG 1. Сверхэкспрессия мутантных аллелей celR не индуцирует связывание и агрегацию Конго красного на твердой и жидкой средах. (A и B) Штамм NTL7 и штаммы, сконструированные из NTL7, экспрессирующие гены, кодирующие измененные аллели celR , выращивали в течение 2 дней при 28 ° C на чашках ABM, содержащих конго красный (A), и в среде MG / L (B), с тряской.Обе среды содержали соответствующие антибиотики. FIG 2Мутантные аллели celR не стимулируют выработку целлюлозы. (A и B) Штаммы NTL7, NTL7Δ cel , NTL7Δ celR : Gm и сконструированные штаммы, сверхэкспрессирующие аллели celR (A) или экспрессирующие аллели, введенные вставкой Tn 7 (B), выращивали в MG / L среды с соответствующими антибиотиками в течение 2 дней при 28 ° C при встряхивании. Клетки собирали и оценивали на продукцию антрон-реагирующего материала, как описано в разделе «Материалы и методы».Значения представляют собой средние значения четырех образцов для каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов.
CelR регулирует биосинтез целлюлозы посредством ее активации и синтеза c-di-GMP. Хотя избыточная экспрессия мутантов CelR D53A и E373A не влияет на фенотипы, связанные с синтезом целлюлозы, эти результаты не устанавливают роль этих остатков в стимулировании производства полимера. Поэтому мы протестировали celR D53A и celR E373A на их способность дополнять мутант indel celR , штамм NTL7Δ celR :: Gm.Как описано ранее (22), мутант Δ celR не продуцирует целлюлозу по сравнению с NTL7 дикого типа (рис. 2В). Экспрессия celR дикого типа из его природного промотора в мутанте восстанавливала продукцию целлюлозы до уровней дикого типа (фиг. 2B). Дополнение мутанта indel либо celR D53A, либо celR E373A не привело к восстановлению синтеза целлюлозы по сравнению с мутантом без комплементации (фиг. 2B). Взятые вместе, данные показывают, что CelR требует как консервативного аспартата в домене CheY, так и консервативного глутамата в мотиве GGEEF для стимуляции выработки целлюлозы.
Мутация Asp53 → Glu в первом домене CheY CelR приводит к увеличению продукции целлюлозы. Анализ мутанта CelR D53A показывает, что эта аминокислота является критически важной для правильного функционирования белка. В белках, содержащих похожие CheY-подобные приемные домены, остаток аспартата может быть фосфорилирован (46), и преобразование этого остатка в глутамат часто приводит к конститутивно активной форме белка (30). Мы изучили роль Asp53 в CelR, изменив этот остаток на глутамат и оценив его влияние на синтез целлюлозы.Сверхэкспрессия celR D53E в NTL7 A. tumefaciens приводила к увеличению продукции целлюлозы даже по сравнению со штаммом, сверхэкспрессирующим celR дикого типа (фиг. 3). Дополнение мутанта Δ celR с помощью celR D53E, вставленного в единицу числа копий и экспрессированного с его нативного промотора, также привело к повышенным уровням синтеза целлюлозы по сравнению с мутантом, дополненным celR дикого типа (рис. 3). Эти наблюдения предполагают, что замена глутамата на аспартат в положении 53 приводит к более активной форме CelR.Взятые вместе, наши результаты согласуются с представлением о том, что CelR является истинной c-di-GMP синтазой и что она является частью сигнального пути, который включает фосфорилирование по Asp53 в домене CheY.
FIG 3Мутация Asp53 из celR в глутамат увеличивает производство целлюлозы. (A и B) Штаммы NTL7, NTL7Δ cel и NTL7Δ celR : Gm либо сверхэкспрессируют celR D53E (A), либо экспрессируют celR D53E из Tn . 7 вставок (B) выращивали в MG / L. среда с соответствующими антибиотиками в течение 2 дней при 28 ° C при встряхивании.Клетки собирали и оценивали на продуцирование целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой средние значения четырех образцов для каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов.
Неповрежденный домен PilZ CelA необходим для биосинтеза целлюлозы. Наличие домена PilZ на CelA предполагает, что полная активность синтазы целлюлозы зависит от связывания c-di-GMP. Изменение консервативного серина в доменах PilZ других белков может привести к значительному снижению аффинности связывания нуклеотидного сигнала (47, 48).На основе этих наблюдений мы проверили, необходим ли интактный домен PilZ CelA, сравнив уровни целлюлозы, продуцируемой мутантом celA , дополненным геном дикого типа или celA S594A, аллелем с мутацией в консервативный серин (см. рис. S1 в дополнительном материале) (7). Как и ожидалось, мутант celA :: lacZ не продуцировал детектируемых уровней целлюлозы (фиг. 4A). Добавление к мутанту indel celA дикого типа, экспрессируемого из pSRK-Gm, приводило к восстановлению продукции целлюлозы до уровней дикого типа (рис.4A), подтверждая, что мутация celA не является вредно полярной на celB и celC . Однако экспрессия аллеля celA S594A не смогла восстановить продукцию целлюлозы до уровней, наблюдаемых в штамме NTL7Δ celA :: lacZ , дополненном геном дикого типа (фиг. 4A). Кроме того, в то время как сверхэкспрессия celA дикого типа в штамме NTL7 привела к высокому уровню продукции целлюлозы, избыточная экспрессия celA S594A в этом штамме привела к значительно более низким уровням полимера (рис.4А). Этот результат предполагает, что celA S594A оказывает умеренное доминантно-отрицательное действие на ген дикого типа. Более того, эти результаты подтверждают требование для домена PilZ CelA.
FIG 4Субъединица целлюлозы CelA требует интактного домена PilZ для полного стимулирования производства целлюлозы. (A) Аллели celA , экспрессированные на pSRK-Gm, вводили в штаммы NTL7 и NTL7Δ celA :: lacZ , и сконструированные штаммы исследовали на предмет получения целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы».Значения представляют собой средние значения четырех образцов для каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов. (B) Ген celR дикого типа был сверхэкспрессирован либо в штамме NTL7, либо в NTL7Δ celA :: lacZ , содержащем аллели celA , и оценивался на продуцирование целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой средние значения четырех экспериментов с полосами ошибок, отображающими стандартные ошибки экспериментов. (C) Штаммы NTL7 и NTL7Δ celA :: lacZ выращивали в среде MG / L, содержащей соответствующие антибиотики, в течение ночи.Клетки собирали и исследовали на активность β-галактозидазы, как описано в разделе «Материалы и методы». Каждый эксперимент повторяли девять раз, и планки ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов.
В тщательно изученных системах мутация остатка серина в домене PilZ снижает, но не устраняет аффинность связывания c-di-GMP (47). Таким образом, возможно, что влияние мутантного домена PilZ на синтез целлюлозы может быть компенсировано сверхэкспрессией celR .Мы проверили эту возможность путем сверхэкспрессии celR в штамме NTL7Δ celA :: lacZ , дополненном либо аллелем celA дикого типа, либо аллелем celA S594A. Сверхэкспрессия celR в мутанте celA , дополненном геном celA дикого типа, приводила к повышенным уровням целлюлозы по сравнению с исходным штаммом (фиг. 4B). Кроме того, сверхэкспрессия celR увеличивала продукцию целлюлозы в мутанте celA , дополненном celA S594A, хотя и не до уровней мутанта, дополненного celA дикого типа (рис.4Б). Результаты показывают, что увеличение концентрации c-di-GMP может частично компенсировать мутацию в домене PilZ CelA.
Изменение экспрессии celR не влияет на транскрипцию celA . Хотя наши результаты показывают, что сигнал c-di-GMP, продуцируемый CelR, стимулирует синтез целлюлозы через домен PilZ CelA, возможно, что CelR или его нуклеотидный сигнал продукт индуцирует транскрипцию гена celA . Чтобы определить, влияет ли CelR на экспрессию celA , мы использовали транскрипционное слияние lacZ в штамме NTL7Δ celA :: lacZ .Как показано на фиг. 4C, мутант-репортер экспрессирует celA на умеренном уровне. Сверхэкспрессия celR в мутанте celA привела к 2-кратному снижению активности β-галактозидазы по сравнению с родительским штаммом (рис. 4C), в то время как удаление celR в мутанте-репортере привело к несколько более низким уровням β-галактозидазы. -галактозидазная активность по сравнению с родительским штаммом (рис. 4С). Эти результаты предполагают, что celR , экспрессируемое на нормальном уровне, оказывает незначительное влияние или не оказывает никакого прямого действия на транскрипцию celA .
Регулятор ответа DivK влияет на выработку целлюлозы через CelR. В A. tumefaciens celR является дистальным геном в двухгенном опероне, который начинается с atu1296 , гена, обычно обозначаемого как divK (см. Рис. S1 в дополнительном материале). Продукт хорошо изученного ортолога-основателя, divK в Caulobacter crescentus, необходим для локализации факторов, участвующих в делении клеток, а также для активации PleD, ортолога CelR (27, 49, 50).Учитывая оперонную структуру divK-celR и функцию divK в других альфа-протеобактериях, эти наблюдения предполагают возможность того, что divK играет роль в стимуляции синтеза целлюлозы.
Сначала мы оценили роль divK в регулировании выработки целлюлозы путем делеции гена divK , создав штамм NTL7Δ divK :: Km. Мутант продуцировал значительно меньшие количества полимера по сравнению с диким типом и соответствовал количеству целлюлозы, продуцируемой мутантом Δ celR (рис.5А). Этот эффект на продукцию целлюлозы, скорее всего, обусловлен полярной природой индель-мутации Δ divK на celR . При введении в этот мутант в единственной копии celR под контролем его нативного промотора заметно увеличивало синтез целлюлозы, хотя и не до уровней дикого типа (фиг. 5A). Интересно, что этот штамм продуцировал уровни целлюлозы, эквивалентные уровням, продуцируемым штаммом NTL7Δ celR :: Gm, дополненным аллелем D53A celR (рис.5A), предполагая, что DivK играет роль в пути активации CelR. Дополнение NTL7Δ divK :: Km хромосомно встроенной конструкцией, содержащей как divK , так и celR (Tn 7 -pr divKcelR ), восстановило выработку целлюлозы до уровней дикого типа (фиг. 5A). Этот результат предполагает, что именно отсутствие celR в мутанте с делецией divK-celR отвечает за большую часть, но не все, этого снижения уровней целлюлозы, наблюдаемого в NTL7Δ divK :: Km.
FIG 5DivK требуется для полной стимуляции производства целлюлозы с помощью CelR. (A) Штаммы с мутациями в divK и celR были исследованы на получение целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Каждый эксперимент повторяли четыре раза. Значения представляют собой средние значения для четырех образцов каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов. (B) Ген celR был сверхэкспрессирован в штаммах NTL7, NTL7Δ celA :: lacZ и NTL7Δ divK :: Km, и сконструированные штаммы оценивали на продуцирование целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы».Каждый эксперимент повторяли четыре раза. Значения представляют собой средние значения для четырех образцов для каждой деформации, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов. (C) Либо celR , либо celR D53E вводили в штаммы NTL7 и NTL7Δ divK :: Km путем вставки Tn 7 , и сконструированные штаммы исследовали на предмет получения целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Каждый эксперимент повторяли четыре раза. Значения представляют собой средние значения четырех образцов для каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов.
Влияние DivK предполагает, что этот CheY-подобный белок, предполагаемый регулятор ответа (8, 9), необходим для CelR-опосредованной стимуляции синтеза целлюлозы. Если это верно, полный эффект сверхэкспрессии celR должен потребовать выраженной копии divK . Чтобы проверить эту гипотезу, pKK38 celR был введен в штамм NTL7Δ divK :: Km, дополненный либо Tn 7 -pr celR , либо Tn 7 -pr divKcelR .Сверхэкспрессия celR действительно приводила к умеренному увеличению продукции целлюлозы в штамме NTL7Δ divK :: Km или NTL7Δ divK :: Km / Tn 7 -pr celR (фиг. 5B). Эта повышенная экспрессия celR не смогла полностью компенсировать потерю divK , что дополнительно демонстрирует важность гомолога CheY в сигнальном пути. Когда celR было сверхэкспрессировано в мутанте с делецией divK , дополненном Tn 7 -pr divKcelR , уровни накопления целлюлозы были значительно выше, превышая даже уровни, наблюдаемые в NTL7 дикого типа с избыточной экспрессией celR (рис.5Б).
Эти результаты подтверждают участие DivK в сигнальном пути, который активирует CelR. Чтобы проверить это требование для DivK, мы определили, стимулирует ли конститутивно активная форма celR выработку целлюлозы у мутанта divK . Как описано ранее, по сравнению с celR дикого типа сверхэкспрессия celR D53E в штамме NTL7 приводила к значительному увеличению продукции целлюлозы (фиг. 3A). При введении celR дикого типа в штамм NTL7Δ divK :: Km не восстанавливалась продукция целлюлозы до уровней дикого типа (рис.5C), введение конститутивно активной формы дигуанилатциклазы давало значительно более высокие уровни целлюлозы в мутанте divK (фиг. 5C). На основании этих результатов мы заключаем, что конститутивно активная форма CelR может компенсировать потерю divK , и из этого следует, что DivK участвует в пути активации CelR.
Остатки аспартата в доменах CheY как DivK, так и CelR важны для производства целлюлозы. Эффекты изменения консервативных остатков аспартата divK и celR позволяют предположить, что эти два остатка имеют решающее значение для стимуляции синтеза целлюлозы.Чтобы изучить роль этих двух остатков, оперон divK-celR был удален, а полученный штамм NTL7Δ divKcelR был дополнен аллелями дикого типа и мутантными аллелями divK и celR с использованием мини- Tn 7 хромосомная система вставки. Удаление divK и celR привело к 5-кратному снижению продукции целлюлозы по сравнению с родительским элементом дикого типа (фиг. 6A). Дополнение мутанта Tn 7 -pr divKcelR , в котором оба гена являются генами дикого типа, восстановило выработку целлюлозы до уровней дикого типа, в то время как комплементация только divK или celR полностью не восстановила синтез полимера (рис.6А). Эти результаты согласуются с результатами нашего анализа комплементации мутанта divK с любым геном (рис. 5). Дополнение мутации Δ ( divK-celR ) divK D53A или divK D53E привело к умеренному увеличению уровней продукции целлюлозы (рис. 6B), что позволяет предположить, что присутствие divK оказывает незначительное влияние на полимер. производство. Введение celR D53A в мутант Δ ( divK-celR ) также не привело к полному восстановлению синтеза целлюлозы (рис.6Б). С другой стороны, дополнение мутации celR D53E восстановило выработку целлюлозы до уровней, превышающих уровни дикого типа (фиг. 6B). Эта конститутивно активная CelR может компенсировать потерю предполагаемого регулятора ответа, в то время как CelR дикого типа не предполагает, что DivK необходим для CelR для полной стимуляции выработки целлюлозы.
FIG 6Для стимуляции синтеза целлюлозы необходимы как celR , так и divK . (A и B) Штамм NTL7Δ divKcelR был дополнен вставкой Tn 7 с диким типом divK , celR или опероном divK-celR (A) и аллелями divK или celR. изменен на Asp53 (B).Штаммы оценивали на производство целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой средние значения четырех образцов для каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов.
Для более полной оценки роли аспартатных остатков как celR , так и divK , оперон divK-celR с мутацией divK или celR на D53 был повторно введен в divK- Двойной мутант celR с числом единичных копий с использованием системы Tn 7 .A. tumefaciens NTL7Δ divKcelR , дополненный divK дикого типа и celR D53A, не увеличивал продукцию целлюлозы по сравнению с родительским мутантом (фиг. 7A). Однако комплементация дикого типа divK и celR D53E приводила к 2-кратному увеличению синтеза целлюлозы по сравнению с уровнями полимера, продуцируемого NTL7 дикого типа (фиг. 7A). Дополнение двойного мутанта celR дикого типа и divK D53A восстановило выработку целлюлозы до уровней дикого типа (рис.7A), в то время как комплементация дикого типа celR и divK D53E приводила к уровням целлюлозы, в 2 раза превышающим уровни, наблюдаемые в штамме NTL7 (фиг. 7A). Эти данные показывают, что аллели D53E как celR , так и divK стимулируют выработку целлюлозы.
FIG 7Аспартат в положении 53 как в DivK, так и в CelR необходим для стимуляции выработки целлюлозы. (A и B) Штамм NTL7Δ divKcelR был дополнен вставкой Tn 7 с pr divKcelR , содержащей измененную форму divK или celR в Asp53 (A) или с divK и celR. мутировал по Asp53 (B).Клетки выращивали, собирали и оценивали на продуцирование целлюлозы, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения представляют собой средние значения четырех образцов для каждого штамма, а полосы ошибок отображают стандартные ошибки экспериментов.
Эффект мутации ключевого остатка аспартата в глутамат как в DivK, так и в CelR предполагает, что изменение остатка в обоих белках также увеличивает производство целлюлозы. Чтобы проверить эту гипотезу, мутант с делецией divK-celR был дополнен вставкой mini-Tn 7 , несущей оба гена, мутировавшие по Asp53.Вставка divK D53A- celR D53A или divK D53E- celR D53A не привела к значительно более высоким уровням целлюлозы по сравнению с исходным мутантом (фиг. 7B), что позволяет предположить, что divK отдельно не дает стимулируют синтез целлюлозы. Когда divK D53A- celR D53E или divK D53E- celR D53E были вставлены в двойной мутант, дополненные штаммы продуцировали количества целлюлозы, сравнимые или несколько превышающие количества, производимые NTL7 дикого типа (рис.7Б). Эти результаты предполагают, что конститутивно активный CelR стимулирует выработку целлюлозы независимо от аллельной природы Asp53 в divK .
Удаление divK влияет на морфологию клеток. У C. crescentus DivK действует как критический регулятор контрольной точки для развития клеточного цикла (50, 51). DivK также участвует в регуляции деления клеток A. tumefaciens; Удаление гена divK приводит к морфологически аномальным клеткам (29). Мы оценили влияние удаления divK и celR на морфологию клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии.По сравнению с родителем, мутант Δ ( divK-celR ) показал большее количество клеток с морфологическими дефектами, включая разветвленные и удлиненные формы (сравните фиг. 8A и B; таблица 3). Дополнение мутации Tn 7 -pr divKcelR восстановило частоту аномальных морфологий клеток до уровня дикого типа (сравните фиг. 8A и C; таблицу 3). Как и ожидалось из отчета Kim et al. (29), дополнение двойного мутанта только divK снизило частоту дефектов морфологии клеток до уровней дикого типа (рис.8F и таблица 3). Более того, конститутивно активная форма divK дополняла дефекты в штамме NTL7Δ divKcelR в присутствии или в отсутствие celR (фиг. 8G и H и таблица 3). Однако дополнение мутанта Δ ( divK-celR ) только pr celR или pr celR D53E не уменьшало количество клеток, демонстрирующих морфологические дефекты (рис. 8D, E и таблица 3), что позволяет предположить, что celR не влияет на процессы, контролирующие морфологию.Эти результаты подтверждают участие divK в делении клеток A. tumefaciens, но предполагают, что celR не играет роли в регуляции клеточного цикла.
FIG 8Удаление divK влияет на морфологию клеток. Культуры штамма NTL7 и его производных выращивали в среде MG / L, и образцы просматривали с помощью фазово-контрастной микроскопии, как описано в разделе «Материалы и методы». (А) NTL7; (B) NTL7Δ divKcelR ; (C) NTL7Δ divKcelR / Tn 7 -pr divKcelR ; (D) NTL7Δ divKcelR / Tn 7 -pr celR ; (E) NTL7Δ divKcelR / Tn 7 -pr celR D53E; (F) NTL7Δ divKcelR / Tn 7 -pr divK ; (G) NTL7Δ divKcelR / Tn 7 -pr divK D53E; (H) NTL7Δ divKcelR / Tn 7 -pr divK D53E celR .Белые стрелки указывают на разветвленные или удлиненные клетки. Прутки, 10 мкм.
ТАБЛИЦА 3Потеря divK приводит к увеличению частоты разветвленных и деформированных клеток
CelR образует гомодимеры, но не взаимодействует с DivK. То, что DivK способствует регуляции продукции целлюлозы посредством CelR, предполагает, что CheY-подобный белок является компонент пути активации DGC. Поскольку DivK функционирует путем связывания со своими мишенями у других видов альфа-протеобактерий (50), возможно, что белок взаимодействует напрямую с CelR.Мы проверили эту гипотезу с помощью бактериального двухгибридного анализа, как описано в разделе «Материалы и методы». В этом анализе взаимодействие между двумя белками приводит к репрессии lacZ , что приводит к образованию светло-голубых колоний при выращивании клеток на среде, содержащей X-Gal. Двухгибридный штамм, экспрессирующий celR из pSR659, образовывал светло-голубые колонии в присутствии X-Gal, предполагая, что DGC взаимодействует с самим собой с образованием активного гибридного репрессора LexA (фиг. 9A). Мутация Asp53 в Ala или Glu не повлияла на эту реакцию (рис.9A), предполагая, что, хотя CelR гомодимеризуется, это взаимодействие не зависит от индуцированных сигналом модификаций в Asp53. Штаммы, экспрессирующие CelR дикого типа и DivK на отдельных плазмидах, гидролизовали X-Gal (фиг. 9B), что свидетельствует о неспособности этих двух белков взаимодействовать. Мутация Asp53 в аланин или глутамат как на DivK, так и на CelR не приводила к положительной реакции на взаимодействие белков (фиг. 9B и C).
FIG 9CelR образует гомодимеры, но не взаимодействует с DivK. (A) Репортерный штамм SU101 с положительным (pDP804) и отрицательным контролями (pSR659) и с двухгибридными векторами экспрессии, содержащими аллели celR .(B) Репортерный штамм SU202, содержащий положительный (pDP804 / pMS604) и отрицательный контроль (pSR658 / pSR659) и двухгибридные экспрессионные векторы с divK дикого типа и измененными аллелями celR или celR и измененными аллелями дивК . (C) Репортерный штамм SU202, содержащий положительный (pDP804 / pMS604) и отрицательный контроль (pSR658 / pSR659), а также двухгибридные векторы экспрессии с измененными аллелями divK и celR . Все штаммы выращивали на чашках с агаром LB, содержащем соответствующие антибиотики, IPTG и X-Gal, в течение ночи при 28 ° C.
ОБСУЖДЕНИЕ
CelR регулирует синтез целлюлозы посредством продукции c-di-GMP. Ранее мы сообщали, что предполагаемая дигуанилатциклаза CelR необходима для стимуляции выработки целлюлозы в A. tumefaciens (22). Учитывая, что CelR содержит как CheY-подобный домен приемника ответа, так и каталитический домен GGEEF (см. Рис. S1 в дополнительном материале), мы предположили, что CelR является частью сигнальной системы, которая контролирует синтез целлюлозы. Недавние биохимические исследования показали, что CelR, вероятно, продуцирует c-di-GMP (52), но не связывает этот сигнал с регуляцией синтеза целлюлозы.Наши результаты, представленные здесь, демонстрируют, что CelR требует каталитического мотива GGEEF, чтобы стимулировать производство полимера; мутант, модифицированный по этому мотиву, не смог комплементировать штаммы, в которых было удалено celR (фиг. 3). Это наблюдение в сочетании с результатами Xu et al. (52), поддерживает нашу гипотезу о том, что CelR является добросовестной циклазой и что циклический динуклеотидный сигнал, продуцируемый этим ферментом, влияет на синтез целлюлозы.
CelR требует консервативного остатка аспартата в домене CheY для стимуляции выработки целлюлозы.Сохранение аспартата в CheY домене CelR и его ортологов у других видов (см. Рис. S2 в дополнительном материале) предполагает, что остаток важен для активации белка, вероятно, как мишень для фосфорилирования (46). Наши текущие результаты подтверждают эту гипотезу; мутация аспартата 53 в аланин отменяет CelR-зависимую стимуляцию выработки целлюлозы либо при сверхэкспрессии, либо при использовании мутантного аллеля для комплементации мутанта с делецией celR (рис.3). Похожая мутация в консервативном аспартате в домене CheY PleD C. crescentus препятствовала построению клетками полярно расположенного фиксирующего стебля (23, 25, 31).
В случае PleD C. crescentus мутация консервативного аспартата в домене CheY на глутамат создает конститутивно активную форму белка; Экспрессия мутантного аллеля приводит к усиленному образованию удерживающих структур и деформированных клеток (25). В других белках с рецепторными доменами, связанными с CheY, преобразование остатка аспартата в глутамат часто, но не всегда, имитирует активированное состояние (53, 54).Эти наблюдения предполагают, что аналогичная мутация в celR приведет к конститутивно активной форме белка. Действительно, либо сверхэкспрессия celR D53E, либо дополнение мутанта Δ celR мутантным аллелем приводило к увеличению количества синтеза целлюлозы по сравнению с мутантом с делецией, экспрессирующим celR дикого типа (фиг. 3). Взятые вместе, наш анализ двух мутантов Asp53 CelR предполагает, что для его активности белок требует активации, вероятно, путем фосфорилирования консервативного остатка аспартата.
То, что CelR требует активации, вероятно, киназой, предполагает, что синтез целлюлозы контролируется некоторыми еще не идентифицированными сигналами окружающей среды, которые приводят к доставке c-di-GMP от DGC к мишени, находящейся дальше по пути. На сегодняшний день наши попытки идентифицировать сигнал окружающей среды, который стимулирует производство целлюлозы, не увенчались успехом (данные не показаны). Дальнейшая работа будет необходима для идентификации как восходящего сигнала, так и киназы, активирующей CelR.
Домен PilZ CelA необходим для синтеза целлюлозы.Учитывая, что CelR является добросовестной c-ди-GMP-синтазой, должен быть нижестоящий сигнальный рецептор, который участвует в синтезе целлюлозы. У многих организмов каталитическая субъединица целлюлозосинтазы, включая CelA A. tumefaciens, содержит c-ди-GMP-связывающий домен PilZ (19). Определенные остатки в PilZ-содержащих белках, включая серин в мотиве DXSXXG, необходимы для связывания c-di-GMP (55, 56). CelA в A. tumefaciens содержит этот мотив, и мутация Ser594 на аланин предотвращает полную комплементацию мутанта с делецией celA (рис.4), предполагая, что остаток серина в этом мотиве необходим для синтеза целлюлозы. В in vitro исследованиях PlzD холерного вибриона и Alg44 синегнойной палочки (47, 55) мутация этого серина снижает аффинность связывания c-ди-GMP. Можно было ожидать, что увеличение уровней сигнала может компенсировать более низкое сродство измененного домена PilZ в CelA. Действительно, сверхэкспрессия celR несколько стимулировала синтез целлюлозы в мутанте с делецией celA , дополненном celA S594A (рис.4), что еще раз подтверждает роль c-di-GMP в регулировании производства полимера.
Мы рассмотрели возможность того, что CelR каким-то образом регулирует транскрипцию регулона cel . Основываясь на наших анализах слияния celA :: lacZ , экспрессия синтазы из ее нативного промотора относительно низкая (фиг. 4A). Мутация или сверхэкспрессия celR существенно не влияла на уровень экспрессии celA , что позволяет предположить, что циклаза не влияет на транскрипцию оперона celABC .Этот результат дополнительно подтверждает нашу гипотезу о том, что CelR стимулирует выработку целлюлозы за счет активации CelA через c-di-GMP.
Взятые вместе, наши наблюдения согласуются с путем, по которому CelR продуцирует c-di-GMP, и с этим сигналом, стимулирующим синтез целлюлозы путем активации CelA. Биохимический анализ BcsA в Salmonella enterica серотипа Typhimurium, гомологе CelA, продемонстрировал, что связывание c-di-GMP активирует синтез целлюлозы и что мутация критических связывающих остатков в домене PilZ отменяет связывание сигнала и ферментативную активность (57, 58).Согласно существующей модели, связывание сигнала в домене PilZ BcsA аллостерически контролирует выработку целлюлозы, запуская конформационные изменения в комплексе, которые приводят к увеличению ферментативной активности (57, 58). Более того, поскольку CelR требует активации для синтеза c-di-GMP, объединенные результаты предполагают, что любая стимуляция продукции полимера с помощью CelA требует восходящего сигнального каскада.
DivK участвует в регуляции синтеза целлюлозы через CelR. Оперональная организация celR с divK предполагает, что оба гена участвуют в регуляции синтеза целлюлозы.Предыдущие исследования показали, что DivK C. crescentus является регулятором ответа CheY-типа и фосфорилируется гибридной киназой DivJ (26, 50). Наши исследования DivK у A. tumefaciens подтверждают роль этого предполагаемого регулятора ответа в стимулировании выработки полимера посредством CelR. В мутанте с делецией divK CelR дикого типа не смог полностью стимулировать выработку целлюлозы (фиг. 5). Однако конститутивно активная форма c-ди-GMP-синтазы компенсировала потерю регулятора ответа; экспрессия celR D53E восстанавливала синтез полимера до мутанта divK .Эти результаты предполагают, что DivK важен для Asp53-зависимой активации CelR и последующей стимуляции синтеза целлюлозы.
То, что DivK состоит из одного CheY-подобного домена (см. Рис. S1 в дополнительном материале) с его консервативным остатком аспартата, предполагает, что белок активируется аналогично CelR. Действительно, превращение Asp53 в DivK в аланин предотвращает полную стимуляцию синтеза целлюлозы (рис. 6). С другой стороны, дополнение мутанта Δ divK аллелем divK D53E привело к более высоким уровням целлюлозы по сравнению с мутантом с делецией, дополненным divK дикого типа (рис.5 и 7). В соответствии с этой интерпретацией уровни целлюлозы, продуцируемой мутантом divK D53E, были сопоставимы с уровнями, наблюдаемыми для штаммов, экспрессирующих celR D53E (фиг. 7B). Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что DivK, как и многие другие члены семейства CheY, может быть активирован, вероятно, путем фосфорилирования по Asp53, и что эта активация является частью сигнального пути, который приводит к активации CelR.
У C. crescentus фосфорилированный DivK взаимодействует со своей мишенью, главным регулятором ответа CtrA, что приводит к локализации комплекса CtrA-DivK на полюсе-мишени клетки (50, 59, 60).Основываясь на нашем двухгибридном анализе, DivK не взаимодействует напрямую с CelR (фиг. 8), хотя наш двухгибридный анализ показывает, что CelR, вероятно, гомодимеризуется. Последний результат согласуется с нашим наблюдением, что мутация celR D53A проявляет доминирующую негативность (рис. 2), а также с кристаллографическими и биохимическими исследованиями PleD, ортолога CelR у C. crescentus (31, 43). Интересно, что DGC-активность PleD требует димеризации (31). Ясно, что DivK д. Взаимодействовать с некоторой вышестоящей киназой, и в своей фосфорилированной форме он должен взаимодействовать с некоторой нижестоящей мишенью, которая влияет на состояние фосфорилирования CelR.Хотя у нас нет доказательств того, что DivK напрямую взаимодействует с CelR, регулятор ответа может локализовать другие компоненты сигнального пути. Дальнейшие исследования этих взаимодействий будут необходимы, чтобы определить механизм, с помощью которого DivK участвует в регуляции синтеза целлюлозы.
DivK, но не CelR, участвует в путях как синтеза целлюлозы, так и деления клеток. В дополнение к регулированию синтеза целлюлозы недавнее исследование Kim et al. (29) ясно показали, что DivK участвует в регуляции процессов, важных для деления клеток у A.tumefaciens. Наши результаты подтверждают эту гипотезу; Удаление divK приводило к дефектам деления клеток, что иллюстрируется удлиненными и разветвленными клетками (фиг. 8). У некоторых альфа-протеобактерий, включая A. tumefaciens и родственный Sinorhizobium meliloti, divK и его ортологи связаны как с полярной локализацией белков деления клетки (25, 28, 29, 61, 62), так и с инициацией S-фазы через локализацию и деградацию CtrA (51). В сочетании с нашими наблюдениями, что DivK необходим для активации CelR, ясно, что CheY гомолог A.tumefaciens сохраняет свою роль в регулировании деления клеток, а также в модуляции синтеза целлюлозы.
Такая роль DivK в других альфа-протеобактериях не беспрецедентна. У C. crescentus активированный DivK стимулирует построение стебля и фиксацию сборки, а также запускает развитие клеточного цикла. Регулятор ответа, по-видимому, участвует в этих двух путях, стимулируя гибридные киназы PleC и DivJ, связанные с двумя системами (27, 50, 51). Активированные формы PleC и DivJ либо фосфорилируют, либо дефосфорилируют белки деления клеток и PleD, что сигнализирует о построении стебля (27).Учитывая родство DivK в A. tumefaciens с его ортологами (см. Рис. S3 в дополнительном материале), влияние мутации divK на деление клеток у ряда бактерий (25, 28, 29, 61, 62), и присутствие гомологов divK в большом количестве альфа-протеобактерий (63), вероятно, что этот белок играет решающую роль в регуляции деления клеток у всех альфа-протеобактерий, несущих ген. Кроме того, у C. crescentus DivK связывает производство стеблей с делением клеток путем активации PleD посредством стимуляции активирующей киназы DivJ (27, 50).Таким образом, активированный DivK не только управляет клеточным циклом через S-фазу, но также инициирует конструирование стебля одновременно с развитием клеточного цикла через отдельный путь передачи сигнала.
Наши результаты демонстрируют, что DivK поддерживает двойную функцию у A. tumefaciens, но в отличие от C. crescentus он регулирует эти пути независимо. Мутанты CelR не обнаруживают морфологических дефектов или дефектов развития (22) (Fig. 8), указывая тем самым, что DGC, хотя и требует DivK для активности, не влияет на деление клеток.Кроме того, экспрессия divK D53E стимулировала синтез целлюлозы, но не влияла на морфологию клеток. То, что регуляторные эффекты DivK на продукцию полимера не зависят от контроля деления клеток, предполагает, что DivK регулирует оба процесса, но не обязательно связывает эти два пути.
В то время как роль DivK в регуляции клеточного цикла консервативна у многих альфа-протеобактерий, его адаптация к вторичной регуляторной функции, по-видимому, зависит от соответствующего DGC в опероне.Наблюдение за тем, что CelR приспособился стимулировать синтез целлюлозы у A. tumefaciens и Rhizobium leguminosarum (64), а не регулировать полярную адгезию (22, 64), предполагает, что роль DGC основана на биологической системе, необходимой бактериям. Таким образом, оперон divK-celR ( pleD ) функционирует как система для регулирования видоспецифичных процессов посредством установленных путей передачи сигнала. Двойная роль DivK, вероятно, позволяет некоторым видам альфа-протеобактерий связывать деление клеток с конкретными потребностями, такими как прикрепление или образование биопленки.DivK также может реагировать на различные входные сигналы, что приводит к активации каждого пути на основе этих сигналов.
Учитывая количество процессов, регулируемых c-di-GMP в A. tumefaciens (22, 52), производство и распространение сигнала должны строго контролироваться, чтобы предотвратить перекрестные помехи с другими системами. Требование связывания c-di-GMP с помощью CelA привело к адаптации пути трансдукции, содержащего CelR, для регулирования продукции целлюлозы. Однако некоторые, но не все, DGC могут влиять на синтез целлюлозы при сверхэкспрессии (22).Следовательно, взаимодействие c-di-GMP и CelA должно контролироваться пространственно и временно либо посредством прямого взаимодействия DGC с синтазой, либо посредством локализации CelR рядом с комплексом целлюлозосинтазы. Дальнейший анализ локализации CelR поможет определить, как сигнал c-di-GMP нацелен на CelA.
RCSB PDB — 1MB0: КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА РЕГУЛЯТОРА ОТВЕТА DIVK НА PH 8,0 В КОМПЛЕКСЕ С MN2 +
DivK является важным регулятором ответа грамотрицательной бактерии Caulobacter crescentus и функционирует в сложной фосфорелейной системе, которая точно контролирует последовательность события развития во время цикла деления клетки.Определение структуры этого однодоменного регулятора ответа при различных значениях pH продемонстрировало, что пятицепочечная альфа / бета складка белка DivK полностью определяется только при кислом pH …
DivK является важным регулятором ответа у грамотрицательных бактерий. Caulobacter crescentus и функционирует в сложной фосфорелейной системе, которая точно контролирует последовательность событий развития во время цикла деления клетки. Определение структуры этого однодоменного регулятора ответа при различных значениях pH продемонстрировало, что пятицепочечная альфа / бета складка белка DivK полностью определяется только при кислом pH.Кристаллические структуры апопротеина и связанных с металлом комплексов DivK при более высоких значениях pH выявили синергетическую гибкость петли бета4-альфа4 и спирали альфа4, вызванную связыванием катионов и рН. Это движение увеличивает доступность растворителя для единственного остатка цистеина в белке. Исследования состояния раствора продемонстрировали 200-кратное pH-зависимое увеличение сродства марганца к белку между pH 6,0 и 8,5, что, по-видимому, связано с депротонированием ацидо-основной пары.Взятые вместе, эти результаты предполагают, что гибкость критических областей белка, ионизация остатка цистеина 99 и улучшенные значения K (D) для каталитического иона металла являются сопряженными событиями. Мы предполагаем, что молекулярные события, наблюдаемые в изолированном белке, могут быть необходимы для активации DivK, и что они могут быть достигнуты in vivo посредством специфических белок-белковых взаимодействий между регулятором ответа и его родственными киназами.
Ссылки по теме: & nbsp
- Характеристика и кристаллизация Divk, необходимого регулятора ответа для деления клеток и
Дифференциация Caulobacter Crescentus
Cabantous, S., & nbspGuillet, V., & nbspOhta, N., & nbspNewton, A., & nbspSamama, J.-P.
(2002) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr & nbsp 58: 1249
- Существенный однодоменный регулятор ответа, необходимый для нормального деления клеток и
Дифференциация Caulobacter Crescentus
Hecht, GB, & nbspLane, T., & nbspOhta, N., & NbspSommer, JM, & nbspNewton, A.
(1995) EMBO J & nbsp 14: 3915
Hide Full Abstract
DI Filippo (серия Manta Pro)
Хотите вашу выхлопную систему сейчас? Не ждите больше! Купите сейчас и платите позже до 3 месяцев без процентов.
Часто задаваемые вопросы
Кто может подать заявку?
Должен быть 18 лет
Должен быть гражданином или резидентом Австралии
Должен иметь определенную должность
Как я могу подать заявку? Нажмите Применить сейчас и заполните простую 3-минутную заявку. Вы удивитесь, насколько прост этот процесс!
ПОДАТЬ ЗАЯВКУ
После утверждения и принятия вами условий ZipMoney произведет оплату Exhaust Shop Australia от вашего имени.
Что еще я должен знать?
Хотя беспроцентный план ZipMoney позволяет вам делать покупки сегодня, не внося никаких авансовых платежей, это ссуда, которую необходимо вернуть. Невыполнение этого требования может повлиять на ваш будущий кредитный рейтинг. Планы платежей ZipMoney являются беспроцентными на срок до 3 месяцев, но имейте в виду, что проценты начнут накапливаться после периода беспроцентной оплаты. Вы можете увидеть свой беспроцентный баланс, сколько времени потребуется на погашение кредита и изменить график платежей в своем цифровом кошельке.
Какие преимущества?
Вы можете купить товары, которые хотите, сегодня, не заплатив авансом.
Оплачивая с помощью учетной записи zipMoney, вы можете разделить стоимость покупки и оплатить с течением времени. zipMoney даже платит Exhaust Shop Australia от вашего имени, никакие деньги никогда не переходят из рук в руки. Вам также предоставляется виртуальная учетная запись, поэтому для вашей следующей покупки все, что вам нужно сделать, это войти в свой цифровой кошелек, подтвердить и оплатить. Больше нет необходимости использовать свою кредитную карту или искать ссуду в другом месте.Это просто и удобно.
Какие комиссии? Без депозита, поэтому платить сегодня нечего. Может взиматься разовая плата за учреждение. Не волнуйтесь, это добавлено к вашему беспроцентному балансу. Подробности см. В вашем заявлении и контракте. Применяются минимальные ежемесячные платежи. См. Подробности в вашем контракте и заявке. Беспроцентный период до 3 месяцев, по истечении которого проценты будут начисляться по стандартной годовой процентной ставке. Небольшая ежемесячная административная плата в размере 4,95 долларов США (выплачивается только при наличии задолженности). условия для получения дополнительной информации.Где я могу узнать больше? Для получения дополнительной информации посетите нашу страницу часто задаваемых вопросов для клиентов здесь
Условия использования
Доступно только утвержденным кандидатам. Требуются минимальные ежемесячные платежи, подробности см. В вашем контракте. Выплата только минимальной ежемесячной суммы погашения не приведет к выплате покупки в течение беспроцентного периода. На любой непогашенный остаток по истечении беспроцентного периода будут начислены проценты по стандартной годовой процентной ставке, которая в настоящее время составляет 23 процента.9%. Применяется единовременная плата за учреждение, подробности см. В вашем контракте. Применяется ежемесячная плата за обслуживание учетной записи в размере 4,95 доллара США (при наличии задолженности). Действуют положения и условия, которые доступны в приложении. Кредит предоставлен zipMoney Payments Pty Limited (ABN 58 164 440 993, номер австралийской кредитной лицензии 441878). Посетите wwww.zipMoney.com.au, чтобы узнать больше.
Иммунитет стада (Защита стада) | Знание о вакцинах
Что такое коллективный иммунитет?
Когда большой процент населения вакцинирован, инфекционные болезни распространяются с трудом, потому что не так много людей, которые могут быть инфицированы.Например, если больного корью окружают люди, вакцинированные от кори, болезнь не может быть легко передана кому-либо, и она быстро исчезнет снова. Это называется «коллективный иммунитет», «общественный иммунитет» или «стадная защита», и он обеспечивает защиту уязвимых людей, таких как новорожденные, пожилые люди и те, кто слишком болен для вакцинации.
Коллективный иммунитет защищает не от всех болезней, которые можно предотвратить с помощью вакцин. Лучшим примером этого является столбняк, который передается от бактерий в окружающей среде, а не от других людей, страдающих этим заболеванием.Независимо от того, сколько людей вокруг вас вакцинировано от столбняка, это не защитит вас от столбняка.
Как работает коллективный иммунитет?
Коллективный иммунитет работает только в том случае, если большинство людей вакцинировано (например, 19 из каждых 20 человек должны быть вакцинированы против кори, чтобы защитить людей, которые не были вакцинированы). Если люди не вакцинированы, коллективный иммунитет не гарантирует их защиту. Уровень вакцинации высок в Великобритании в целом, но это скрывает тот факт, что в некоторых частях Великобритании и в некоторых общинах показатели намного ниже.(Чтобы узнать этот показатель в вашем районе, просмотрите таблицы местных данных по охвату общественного здравоохранения Англии.)
Если вы живете в районе, где охват вакцинацией низкий, и ваш ребенок не вакцинирован, весьма вероятно, что многие из людей, с которыми он контактирует, также не будут вакцинированы. Если один из этих людей заразится инфекционным заболеванием, например корью, он может легко передать его другим непривитым людям вокруг них, а в некоторых случаях болезнь может очень быстро распространиться среди населения.Именно это произошло во время вспышки кори в Уэльсе в 2013 году.
В отличие от вакцинации, коллективный иммунитет не обеспечивает высокого уровня индивидуальной защиты, поэтому он не является хорошей альтернативой вакцинации.
Посмотрите анимацию ниже, которая объясняет, как работает коллективный иммунитет. См. Также нашу страницу о том, почему болезнь возникает у вакцинированного населения. Щелкните здесь, чтобы загрузить сценарий анимации.
Люди, зависящие от коллективного иммунитета
Некоторые люди в сообществе полагаются на коллективный иммунитет, чтобы защитить себя.Эти группы особенно уязвимы к болезням, но часто не могут безопасно получать вакцины:
- Люди без полностью работающей иммунной системы, в том числе без работающей селезенки
- Люди с ослабленной иммунной системой, получающие химиотерапию
- Люди с ВИЧ
- Новорожденные, слишком маленькие для вакцинации
- Пожилые люди
- Многие из тяжело больных в больнице
Для этих людей коллективный иммунитет является жизненно важным способом защиты от опасных для жизни заболеваний.См. Эту статью о коллективном иммунитете, написанную родителем четырех мальчиков с первичным иммунным заболеванием, которая начинается со слов «коллективный иммунитет» или, как я предпочитаю, «общественный иммунитет» — это не просто расплывчатое понятие для моей семьи: это буквально что мешает моим детям заболеть … »
Ссылки на дополнительную информацию о коллективном иммунитете
Коклюш и коллективный иммунитет, краткое выступление профессора Адама Финна из Бристольского университета
Сила коллективного иммунитета, доклад Ромина Либстер на TED
Фильтры DEEKAX TALTERI DIVK-C 140
FINNISH DEEKAX TALTERI DIVK-C 140 Комплект фильтров включает:- 1 шт. Кассетного фильтра ORIGINAL DEEKAX F7 / EU7 271 x 466x 36 мм (приточный воздух)
- 1 шт. Белый фильтр грубой очистки G4 / EU4 (отработанный воздух)
Подходит для моделей DIVK-C140 DE, DIVK-C140 DE VKL и DIVK-C 140 SK.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ТОВАРЫ
Нужны дополнительные продукты для вашей вентиляционной установки? Выберите сумму и щелкните выше по дополнительным продуктам, чтобы добавить их в свой заказ.
Дополнительный фильтр грубой очистки (1 шт.)
Размещение маты грубой очистки G4 с кассетой фильтра тонкой очистки F7 для приточного воздуха позволяет кассете фильтра прослужить дольше. Однако фильтрующие прокладки быстрее загрязняются и требуют более частой замены, чем кассеты тонкой очистки.Если чаще менять только фильтры грубой очистки (для приточного и вытяжного воздуха), вам не нужно каждый раз менять более ценную кассету фильтра (F7). Наличие дополнительных фильтров грубой очистки дома экономит ваши деньги и позволяет при необходимости быстро менять фильтры грубой очистки.
Очищающее средство для камеры
Для того, чтобы вентиляционная установка работала должным образом, камеру рекуперации тепла необходимо регулярно очищать. При чистке ячейки используйте только подходящие чистящие средства.Мы рекомендуем очищающее средство Likavex, которое безопасно использовать для очистки вентиляции, а также других мест в доме.
ЗАМЕНА ФИЛЬТРА
Рекомендуемый интервал замены фильтров — 2–3 раза в год. В связи с заменой фильтра очистите вентиляционную установку и удалите возможную рыхлую грязь, например, с помощью пылесоса. Также следует проверить состояние теплообменника и при необходимости очистить его подходящим моющим средством.
КАССЕТНЫЙ ФИЛЬТР:
- Отвечает требованиям классификации F7 в соответствии со стандартами EN779: 2012
- Изготовлен из влагостойкого полиэстера
- Кассета имеет прочную пластиковую рамку
- Финский продукт высокого качества
