Аллен Торрес, 34 года, Турция
Личная информация
Деятельность
скрыта или не указана
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Интересы
скрыты или не указаны
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Любимая музыка
скрыта или не указана
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Любимые фильмы
скрыты или не указаны
Можно редактировать:
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Любимые телешоу
скрыты или не указаны
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Любимые книги
скрыты или не указаны
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Любимые игры
скрыты или не указаны
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Любимые цитаты
скрыты или не указаны
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
О себе
скрыто или не указано
Можно редактировать: да
Обязательно к заполнению: нет
Можно скрыть настройками приватности: да
Whitefurze Allstore 0.
1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm Home & Kitchen Storage Boxes codeseller.ru
Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm Home & Kitchen Storage Boxes codeseller.ruWhitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm,Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm, Natural,1 Litre at UK, Free delivery on eligible orders,Buy Whitefurze Allstore Container with Silver Clamp, Plastic,Fast delivery on All Products,Visit our online shop,we make online shopping easy,Express Shipping And Free Returns. 10 x 6.5 x 2.5 cm Whitefurze Allstore 0.1 L Natural codeseller.ru.
Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm
CodeSeller — активно развивающееся сообщество продавцов и покупателей цифровых товаров.
Мы присутствуем на рынке интернет-продаж уже более семи лет и всё это время мы придерживаемся простых правил — открытости, надёжности и полноценной поддержки.
Мы развиваем тесные партнёрские отношения как с продавцами цифровых товаров, так и покупателями.
Если вы специализируетесь в разработке, то самое время попробовать себя в продажах, используйте наш интернет-магазин цифровых товаров в развитии своего успеха.
Погрузитесь вместе с нами в увлекательный мир интернет-продаж, открывайте для себя что-то новое, становитесь активным участником нашего сообщества!
лет на рынке продаж
оформленных заказов
выгруженных файлов
довольных покупателей
Популярное за месяц
Whitefurze Allstore Container with Silver Clamp, Plastic, Natural, 0. 1 Litre: Kitchen & Home. Buy Whitefurze Allstore Container with Silver Clamp, Plastic, Natural, 0.1 Litre at UK. Free delivery on eligible orders.. Separate lid with clip-lock handles 。 Reinforced base and corners 。 Stackable — lids feature integral location guides for non-slip stacking 。 Made from impact resistant polypropylene 。 Product Description Ideal for organising small items including staples, needles, rubber bands, buttons, paper clips, sequins and screws. 。 Box Contains 1 x Allstore, 0.1 L 。 。 。
/>
Последние товары
Биржа рейтинга между пользователями с произвольными ценами
Мини конструктор чата
Оплаченные недавно
Биржа рейтинга между пользователями с произвольными ценами
Личные сообщения в своём личном кабинете. Теперь ты будешь общаться в своём ЛКПлагин WordPress для выведения блока предпросмотра при наведении на ссылку.
разделение пользователей на группы с ограничением доступа к некоторым возможностям личного кабинета
/>Отзывы о товарах
Шаблон в целом не плох. Но то что он вырубает футер сайта это не нормально.
Последние публикации
Последние задания и проекты
Последние комментарии
Последнее на форуме
Генерация пароляWhitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm
Dinosaurs’ Park Little Boys Girls Jackets Winter Coat Quilted Lightweight Outerwear (Blue, Shoe upper material:PU leater Sole material:Cloth. We have 10 years of experience in martial arts industry and have a good reputation in this field. Buy Computer Cables Advanced 2018 New Cable HDM Computers 1080P HDMI to VGA Male to Female Converter Adapter with USB Power Audio Cable — (Cable Length White): SATA Cables — ✓ FREE DELIVERY possible on eligible purchases, Our wide selection is elegible for free shipping and free returns, Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm, Toddler Girls Mary Jane Flats Kids Bowknot Bridesmaid Wedding Party Dress School Shoes. The distributor can be a contact point type or an electronic type with a pick up coil. Lovejoy 05498 Size 1070 Grid Coupling Hub, This jewelry adds a touch of nature-inspired beauty to your look and makes a standout addition to your collection. Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm. With 48 inch delivery hose and angled spout. The back graphic are text “Smash the control images smash the control machine”. Largest measures approx 4 inches, *Shipped same or next business day. Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm, Our stamps are created with post consumer recycled plastic and are laser-etched in eco-friendly 100% renewable resource red rubber. each Crystal has its own color and shape, Custom sizing available upon request. Cropping and adjustments will occur. Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm. Photo 3: Other tapes in this collection. You Had Better Order One Step Bigger Size than Your Original Size, which is known for their «surfer girl» Wanderlust style. or message us to change backgrounds or sponsor logos (send us message: 1.
Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm
MarinoBIRD High Temperature Silicone Oil Brush Baking Bakeware Bread Cook Pastry Oil Detachable Cream BBQ Basting Brush, BalVau Professional Siphon Cream Whipper Dispenser 500ml,4 Stainless steel Injector Tips & 3 Decorating Nozzles N20 Gas Cannisters Not Included. COMOTS Folding Makeup Chair portable Professional Heavy Duty Directors Chair Lightweight Solid Wood Artist Chair Foldable with side bags Black. Lawei 6 Pcs Porcelain Dinner Plates Round Tableware Serving Platters Dinnerware Dish White 25 cm, Stainless Steel Neff B6ACH7HN0B N50 8 Function SlideAndHide Single Oven With Pyrolytic Cleaning, 5X Stainless Steel Mixing Salad Bowls Silver Shiny Finish 34cm by Chabrias LTD, Little Secrets Clothing Personalised Daddys Saving Fund Fathers Day Money Box Frame Present Gift. MyGift 16-Inch Concrete Grey Round Vanity Tray, zhiwenCZW Transparent Acrylic Solid Roll Clay Rolling Pin Fondant Baking Pastry Roller. Small Single Milliard 10cm Thick Tri Folding Mattress with Ultra Soft Removable Cover with Non-Slip Bottom 190cm X 75cm. Portable Mini Blender Personal Blender Mini Shakes Juicer Cup USB Rechargeable Smoothie Blender for Travel Office Sports School, S SIENOC Aluminium Metal Venetian Blinds Easy Fit 25mm Slat for Home Office for Clamping Privacy Light and Glare Protection. SPARES2GO Course Filter for Swan Dishwasher, HWC Trading Bruce Willis Gift Signed A4 Printed Autograph Die Hard Gifts Photo Display, Home Standard 1-1/4 32mm & 1-1/2 40mm Universal Anti-Vac Telescopic Bottle Trap, Mirrored Crushed Diamond Coffee Table Sleek and Stylish. Large Fashion Colorful Sand Glass Sandglass Hourglass Timer Clear Smooth Glass Measures Home Desk Decor Xmas Birthday Gift 5 Minutes, Blue. EUGAD Blackout Roller Blind for Window No Drilling Blind with Fittings and Coating in Same Colour Grey 100 x 160 cm. Simfonio LED Strip Lights 5M LED Lights Strip with RF Mini Controller RGB LED Light Strip 5M Waterproof 5050 SMD 150Leds with Remote and UK Power Supply. ø35mm, 200cm, black Wessper® Hose for Vacuum Cleaner Parkside PNTS 23E.
Whitefurze Allstore 0.1 L Natural 10 x 6.5 x 2.5 cm
Natural,1 Litre at UK, Free delivery on eligible orders,Buy Whitefurze Allstore Container with Silver Clamp, Plastic,Fast delivery on All Products,Visit our online shop,we make online shopping easy,Express Shipping And Free Returns.
Лилия Басова ВКонтакте, Подольск, Россия, id265635392
Подслушано Подольск
✅Жми подписаться! У тебя есть интересная новость про город Подольск. Можешь поделиться ей на стене сообщества «Предложить новость». Подслушано Подольск — это новостной портал, ДТП, последние события, рыбалка, рассказы автомобилистов, последние новости.
Черный юмор
Любишь чернее черной черноты бесконечности? Только серьёзный юморок, только хардкор. Твоя личная комната грязи здесь!
Весёлый цемент
Ламповая атмосфера, веселье, доброта.
Подслушали у замужних
Здесь только то, что присылают наши читатели. Поделиться откровением совершенно анонимно можно только добавив вашу историю или новость в «Предложить новости» «Подслушали у Замужних» — социальный проект, в котором люди делятся каждый день своими секретами, откровениями и жизненными ситуациями анонимно перед огромной аудиторией. Добро пожаловать! Если вы впечатлительны и высокоморальны, просим вас не читать тот контент, который можно увидеть на стене сообщества, лучше сразу закройте эту страницу и не возвращайтесь сюда никогда 🙂 Здесь особенная атмосфера и эмоции от прочитанного здесь очень разнятся. Зачастую нас стоит читать между строк и никогда во время еды. Мнение редакции не всегда совпадает с мнением авторов.
Psychology|Психология
Все о психологии простым языком.
Шедевры рекламы
У нас всё самое вкусное из мира рекламы! Глазами потребителей – учимся видеть то, что скрыто.
С точки зрения маркетологов – изучаем нейромаркетинг, дизайн и креатив.
Через призму предпринимателей – разбираем эффективные приемы и техники.
ИДЕИ
Вместе с группой ИДЕИ вы найдете оригинальные лайфхаки, интересные идеи по декору, простые мастер-классы, дельные советы и многое другое.
MDK
Только для тех, кто в теме. Остановись и оцени сарказм о наболевшем.
Чёрный юмор
Любишь чернее черной черноты бесконечности? Только серьёзный юморок, только хардкор.
Студия «РАФАЭЛЛО’ ПЕРМАНЕНТНОГО МАКИЯЖА
Дипломированный специалист по перманентному макияжу! перекрытие старого пигмента!!!!
Качественные материалы(Америка)
Эффект один год !!!
Проводим Акции!!!!
Мы оказываем следующие процедуры:
🌿 Напыление бровей 3500
🌿 Напыление губ — 3700
г. Подольск ул. 43 Армии 23
Режим работы: с 9:00 — 20:00 Для записи обращайтесь
89851447575
Travelerr — вce o пyтeшecтвияx
Любить жизнь гораздо проще, когда путешествуешь. Там, где никто тебя не знает, все в твоих руках, ты действительно становишься хозяином своей судьбы.
Здесь мы рассказываем о самых красивых местах нашей планеты куда ты можешь отправиться. Путешествуйте с нами!
Тряхни Нормальность
Мы интернет-журнал, о котором знают все. Стань частью нас, читай нас на работе, дома, на улице и с друзьями. Мы то, чего тебе не хватает.
Убойный юмор | Анекдоты, Шутки, Комментарии
Юмор, который понравится каждому. Свежие мемы каждый день, которые заставят тебя смеяться взахлеб.
Юмор Шрёдингера
Мозговой Штурм
Расширяем сознание!
Наука, факты, события, изобретения, бизнес и саморазвитие.
Смейся до слёз 😀
Вдохновение.
— Вдохновение во всех проявлениях
— интересные новости и старости в путешествиях и бытовой жизни!
ОСТРОУМНЫЕ
Заходи почаще в Остроумные — смех продлевает жизнь!!
Корпорация Юмора ツ
Dubliners — The Holy Ground, аккорды, текст
[ Предположительная тональность: D ] THE HOLY GROUND D A D D D A D Adeiu to you my Dinah, A thousand times adieu D Bm G A D A We are going away from the Holy Ground, And the girl that we loved true D A D D D Bm G A We'll sail the salt sea over, And then return once more D Bm G D D A D To see again, The girl we loved, And the Holy Ground once more: FINE GIRL YA'ARE D Bm G A The girl I do adore D Bm G D D A D And still I live in hope to see, The Holy Ground once more: FINE GIRL YA'ARE D A D D D A D And now the storm is raging, And we are far from shore D Bm G A D A And the good old ship is tossing about, And the rigging is all tore D A D D D Bm G A And the secret of my mind, My dear, You're the girl I do adore D Bm G D D A D And still I live in hopes to see, The Holy Ground once more: FINE GIRL YA'ARE D Bm G A The girl I do adore D Bm G D D A D And still I live in hope to see, The Holy Ground once more: FINE GIRL YA'ARE D A D D D A D And now the storm is over, We are safe and well D Bm G A D A We'll go into a public house, And we'll sit and drink like Hell D A D D D Bm G A We will drink strong ale and porter, And make the rafters roar D Bm G D D A D And when our money is all spent, We'll go to sea once more: FINE GIRL YA'ARE D Bm G A The girl I do adore D Bm G D D A D And still I live in hope to see, The Holy Ground once more: FINE GIRL YA'ARE
Заявки всех команд Фестиваля «Арт-футбола»–2016
Заявки всех команд Фестиваля «Арт-футбола»–2016 28.05.2016 15:38
Представляем вашему вниманию заявки всех команд Фестиваля «Арт-футбола»–2016.
Аргентина
Esteban Ernesto Pogany
Ernesto Danielferrón
Daniel Horacio Cersósimo
Enrique Oscar Hrabina
Juan Sebastián Debenedictis
Rubén Quiroga
Matías Andrés Camisani
Esteban Pussacq Laborde
Marcelo Daniel López López
Diego Martín Bosa
Mauro Javier Potenzoni
Fabián Silvio Quintiero
Rafael Arcaute
Jorge Luis Laurino
Juan Carlos Epumer
Gastón Portal
Emanuel Javier Horvilleur
Pablo Rhode
Pascual Fernando Lezcano
Héctor Andrés Bracamonte
Эстония
Allan Muuk
Marek Piliste
Marek Liivik
Marko Lepik
Andrus Lang
Ragnar Selberg
Aivar Kuldsaar
Rauno Otsepp
Aivar Anniste
Daniil Kulagin
Arthur Ragoza
Arthur Vladõtsenko
Leonid Jakunin
Andres Ohu
Martin Kaalma
Stas Kolodub
Германия
Josef Fettich
Miroslav Tanjga
Junior Keith Powel
Milinko Milo
Nabil Kabbouz
Daniel Milo
Mohamed El-Asmer
Neven Dokic
Nikola Vujicic
Salahadin Ismail
Denis Zagorica
Tommy Mueller
Shahrooz Shojaie
Patrick Fernandez Alatorre
Christian Amuri
Georg Christian Seefuss
Dustin Meguid
Mario Pavkovic
Adrian Schedlinski
Jace Carrera
Dieu Carrera
Alfredo Carrera
Marin Bajic
Ahmad EL Asmer
Ibrahim EL Asmer
Nelson Ortiz
Kaye-Ree
Венгрия
Sebők Vilmos
Zalán Zombori
Gábor Egressy
Ottó Vincze
István Karikás
Balázs Péter Kiss
Krisztián Vranik
Balázs Polyák
Miklos Csabankó
József Leányvári
László Spiegelhalter
Csaba Gyetván
Balázs Fekete
Péter Maráz
György Juhász
Gábor Benkő
Gergely Liszkai
Zoltán Fülöp
László Herczeg
Szabó Tamás
Belányi József
László Barna
Szabolcs Kővári
Peter Világi
Csaba Bántó
Batjin Zorigt
Иран
Ebrahim Mirzapour
Hamid REZA Sanaei Safa
Seyed Javad Hashemi
Hossein soleimani
Mojtaba Zarifianfani
Reza(Hessam) Yaryad
Mohammad Siyanaki
Aref Lorestani
Kazem Mohammadi
Mehdi Salehpour
Behzad Monirabbasi
Mahdi Khanmirzaei
Mahdi Hobehdarvish
Hossein Pourkarimi
Alireza Khodaei
Farshid Fahim
Mostafa Enjilei
Mohammad Gheibi
Arash Chamanirad
Mohsen Tanabandeh
SAeid Fakharishaldrh
Saeid Bahri
Seyyed Abolfazl Razavi
Ahmad Reza Taheri Livani
Mohammad Javad Vahedi
Yousef Karami
Италия
Messina Roberto
Ruta Leonardo
Melosi Giuliano
Giordano Ferdinando
Bovi Matteo
Frigo Giovanni
Battaglion Gianluca
Fumo Carlo
Riso Mario
Visentin Fabio
Confalone Simone
Vivio Marco
Balzo Raffaello
Tomasino Tullio
Pezzetti Angelo
Sammarchi Pierluigi
Rastelli Fabio
Saladino Sergio
Ghedina Kristian
Macri Saverio
Mancino Gregorio
Bresciani Angelo
Казахстан
Abdulkarim Karimov
Alexandr Chepukavechus
Ruslan Seitov
Yerlan Alimov
Angsat Dildabay
Amankeldi Mengdibayev
Ayan Birbayev
Adylzhan Umarov
Batyr Bainazarov
Arman Konyrbayev
Medet Kozhekbayev
Rysbek Atashev
Abay Zhansarbayev
Galymzhan Arystanbekuly
Tauyekel Mussilim
Kanat Zhumabekov
Kuanish Keremkulov
Mels Usserbayev
Gadilbek Shurenbaiuly
Nuzhan Kermenbayev
Kuntugan Soltan
Adil Akhmetov
Anuar Matzhanov
Akylbek Doszhanov
Akzhol Serikzhanov
Chingiz Tolegenuly
Ravil Isakov
Alisher Yegemberdiev
Bati\yrzhan Tazabekov
Galymzhan Bersugurov
Корея
Shinwoo Park
Daeryong Kang
Jaehyon You
Gyeongsoon Yong
Junhyun Hong
Soukmin Hong
Eunjin Han
Danhwi Kim
Janghun Kim
Taehwan Youn
Daeyoung Oa
Jaehoon Choi
Gwangyeon Kim
Jonghun Choi
Sonyoung Kim
Kyounghee Park
Wonsuk Choi
Jungchul An
Younghoon Lee
Woosol An
Gapseok Lim
Jungmi Park
Kijung Cho
Yongjin Choi
Eunsun Kim
Нидерланды
Clyde Pinas
Arlindo Fernades
Bryan Gomes Landim
Zenon Zevenbergen
Alperen Akdogan
Delvin Delgado
Guilliano Krolis
Djeison Gomes Ferreira
Nelson Gomes Ferreira
Jerry Gomes Ferreira
Aristotiles Nascimento
Joachim Gomes
Arlindo Timas Silva
Ampario Gomes Fereira
Rodchenko Monkau
Brian Ramdhan
Esteban Sanchez Moreno
Edar Salamao
Ian van der Stap
Rudy Dias Lima
Francisco Da Cruz Dos Anjos
Румыния
Lazar Mihail Mugur Pastorel
Temisan Radu Aurelian Cornel
Cruceru Daniel
Oprea Razvan Ionut
Stefanescu Bogdan Andrei
Camara Ghedi
Gheorghe Paul Ionut
Lixandru Marcel Florin
Pasat Cornelius
Nae Gabriel Decebal
Varniote Ilie Rares
Ghimisi Lucian
Mateiu Andrei
Stan Valentin
Branzei Mircea Vasile
Iurchivici Marian Aureliu
Dumitrache Cristian
Daniel Chirita
Mitu Dan Marius
Cioanta Beniamin
Moise Florin
Barbu Petru Gabriel
Cimpan Ioan Morosanu
Selesi Cosmin Ovidiu
Россия
Давыдов Юрий
Авербух Илья
Минаев Сергей
Глинников Илья
Запашный Эдгард
Зинчук Виктор
Белоцерковский Дмитрий
Луговых Роман
Мельник Игорь
Пьер Нарцисс
Викулов Иван
Богомазов Игорь
Иванов Павел
Якин Александр
Братов Руслан
Крылов Дмитрий
Пешков Максим
Алёшкин Александр
Нигматуллин Руслан
Рагулин Александр
Хаит Ростислав
Барац Алексей
Махмутов Марат
Булатов Виктор
Сильченко Игорь
Васильев Виктор
Ефремов Валерий
Добрыгин Григорий
Дворкович Аркадий
Сербия
Andrija Kuzmanovic
Aleksandar Radojicic
Viktor Savic
Ivan Jevtovic
Lazar Djukic
Branislav Lalic
Ivan Jevtic
Danijel Cehranov
Milos Petrovic
Marko Djurovski
Vladimir Miladinovic
Nikola Glisic
Luka Tabasevic
Milan Mitrovic
Igor Miljkovic
Marko Gizdavic
Rajko Saric
Nisa Saveljic
Miodrag Andjelkovic
Milos Petrovic
Nikola Serpak
Milos Vilotic
Словакия
Ján Ďurovčík
Samuel Tomeček
Ivan Maljar
Tomáš Medveď
Mario Porubec
Ľuboš Maliňák
Šimon Gerek
Dušan Borbely
Martin Kochan
Marek Hollý
Štefan Maixner
Lukáš Lacko
Peter Herstek
Martin Leco
Vlasta Mudríková
Ivan Matejovič
Juraj Neveselý
Marko Popovski
Ľubomír Orabinec
Michal Rimovský
Ivan Vojtek
Kristián Karsa
Milan Lieskovský
Matej Gális
Ivan Jakeš
Teodor Duchovič
Stanislav Gális
Juraj Želiska
Словения
Milan Pečovnik Pidži
Omar Naber
Dejan Kranjc
Lovro Sadek
Martin Juhart
Nejc Tratnjek
Benjamin Cigler
Nani Franc Matjašič
Bojan Zrnko
Miro Todosovski
Miha Guštin Gušti
Jože Kotnik
Sašo Svarogov
Matjaž Ul
Jan Breznik
Goran Stanković
Robert Korošec
Miha Ribarič
Oskar Drobne
Simon Sešlar
Suad Filekovič
Matej Vračko
Aljoša Debevec
Bojan Prašnikar
Uroš Šmigoc
Tomaž Strgar
Турция
Hakan Meri̇çli̇ler
Deni̇z Cem
Ersi̇n Korkut
Alpay Erdem
Umut Zen
Mustafa Kemal Öztürk
İbrahi̇m Kendi̇rci̇
Ümi̇t Kantarcilar
Buğrahan Çayir
Sertan Öksüz
Mustafa Kocabey
Alper Kyazim Mehmed
Zafer Peker
Vedat Evren Dursun
Burhan Şahi̇n
Uğur Akyürek
Teoman Topcu
Adi̇l Karaca
Bariş Açik
Aydin Çakmak
Sarp Levendoğlu
Volkan Tomak
Великобритания
Rajiv Bukhory
Graham Loki
Daniel Stevens
Lewis Clay
Ike Omorodion
Arran Williams
Roddy Lamba
Arinza Nosike
Emmanuel Ihenacho
Phil Mockett
Nelson Ekaragha
Andre Burford
Isaac Martin
Shameek Farrell
Okuromade Emmanuel
Michael Horne
Neil Raymond
Emlyn Francis
Nicholas Gilmore
Leo Ihenacho
Michel Dinzey
Текст песни Стичи JAMBULA — Минное Поле на сайте Rus-Songs.ru
Оригинальный текст и слова песни
Минное Поле:vk.com/id1995866
final nn-rap 2013
а мы взрываем здесь.. Сормово — минное поле
мимими минное поле, мимими минное поле
тебе здесь не пройти.. Сормово — минное поле
мимими минное поле, мимими минное поле
Начало батла, значит нам пора по парам,
Мне смешно было на вас смотреть, как в квн Парампампарам,
Вдруг — финал..уже воуу фанфары,
Подъезжаю к клубу, вырубает лифан фары
Джамбульский повар окропляет фартук
Резкий старт переходит плавно в партер
Спарта, беспардонный рэп пиздат
Бесспорно, я не звезда, но умею наверх свистать
Век джамбульский симфоний sing for me
Это мир фобий,близко буря, визг фурий,
Мой приз будет,вниз руки, вверх руки, уаууау
Стичи на сцене,бра бери таймаут,
но пока я в андерграунде, я диггер в мраке,
Заходи на огонек, тлеет мой дымный факел,
Грубый настрой твой вынудит сунуть тыкву в кафель,
Ты крут парень но именно тут мне выиграть в кайф
и мы взрываем здесь.. Сормово — минное поле
мимими минное поле, мимими минное поле
тебе здесь не пройти.. Сормово — минное поле
мимими минное поле, мимими минное поле
Из овер сотни тел мы теперь одни на ринге,Вингер,
Видимо, ты выбил Сито, Хаста, Джеки,но мой мидл фингер для тебя детка,прыгай на моём лонгмиксе
из таких же как и ты, я вас всех рвал как миксером
7 раундов на поле боя, дабы ты Бедин Коля понял,
что тебе о победе не время бы грезить,а теперь и тем более ведь
тут джамбула, сынок, выдыхай кайф
Ты качаешь, я раздаю,это как вай-фай
зал дал хай файв, пятачок в небо
а чо ты качок вингер сделал для рэпа, ты где был?
здорово, я голос от арт подвалов,
*джамбула! разложу тебя, как карты таро
лирик из клиник, за всё сопливишь до талова
в треках тока ла ла ла ла мол жизнь наебалово..но
я слышу фальш ты любишь много купюр
а на флейте водосточных труб никогда не сыграешь ноктюрна
и мы взрываем здесь.. Сормово — минное поле
мимими минное поле, мимими минное поле
тебе здесь не пройти.. Сормово — минное поле
мимими минное поле, мимими минное поле
Перевод на русский или английский язык текста песни —
Минное Поле исполнителя Стичи JAMBULA:vk.com/id1995866
final nn-rap 2013
and we explode here .. Sormovo — minefield
mimimi minefield minefield mimimi
You are not to go .. Sormovo — minefield
mimimi minefield minefield mimimi
Home battles, so it’s time for couples,
I was funny to look at you as KVN Parampamparam,
Suddenly — final..uzhe vouu fanfare,
We drive to the club, knocks Lifang lights
Dzhambul chef sprinkles apron
Sharp launch goes smoothly to the ground
Sparta, shameless rap bitching
Undoubtedly, I am not a star, but I can top pirate
Century Jambul symphonies sing for me
This is the world of phobias, close storm shrieking furies,
My prize is down hands up hands uauuau
Stitch on the scene, wall take a timeout,
but while I’m underground, I digger in the darkness,
Come to the light, my smoldering smoky torch
Rough force your spirit to put the pumpkin in the tile,
You’re a tough guy but this is where I win the buzz
and we explode here .. Sormovo — minefield
mimimi minefield minefield mimimi
You are not to go .. Sormovo — minefield
mimimi minefield minefield mimimi
From an over hundreds of bodies we are now alone in the ring, Winger,
Apparently, you’re knocked Sieve, Hasta, Jackie, but my Middle Finger for you baby, jump on my longmikse
of the same as you, I like you all tore mixer
7 rounds on the battlefield, so that you may Bedin Kohl realized
that you do not have to win the time to dream, and now even more so because
Jambul here, son, exhale buzz
You’re swinging, I give it as a wi-fi
Hall gave Hi Five, snout in the sky
Cho you kachok winger did for rap, where have you been?
cool, I voice from art cellars,
* Jambul! the pile for you as tarot cards
lyricist of clinics for all snotty to Talova
in the current tracks la la la la life supposedly naebalovo..no
I hear you like a lot of false bills
and on a drainpipe flute never going to play Nocturne
and we explode here .. Sormovo — minefield
mimimi minefield minefield mimimi
You are not to go .. Sormovo — minefield
mimimi minefield minefield mimimi
Если нашли опечатку в тексте или переводе песни Минное Поле, просим сообщить об этом в комментариях.
В России впервые навечно заблокировали сайт из-за «пиратского» ПО
| Поделиться Мосгорсуд по жалобе компании «1С» заблокировал пожизненно торрент-трекер dark-os.com. Это первый случай пожизненной блокировки ресурса, размещающего пиратские копии софта.Пожизненная блокировка по жалобе «1С»
Роскомнадзор на постоянной основе (пожизненно) заблокировал доступ к торрент-трекеру dark-os.com. Эта информация следует из картотеки Antizapret.info.
Блокировка осуществлена на основании решения Мосгорсуда. С иском в Мосгорсуд обратилась компания «1С», обвинившая трекер в незаконном размещении созданных компанией программ: «1С:Предприятие», «1С:Бухгалтерия», «1С:Государственные и муниципальные услуги», «1С:Экзаменатор», «1С:Консолидация», «1С:Конструктор курсов» и «1С:Налогоплательщик».
Как устроен «антипиратский» закон
Напомним, с 1 мая 2015 г. в России вступила в силу расширенная редакция «антипиратского» закона. Она позволяет владельцам прав на все виды контента (кроме фото) обращаться в Мосгорсуд с целью блокировки доступа к ресурсам, нарушающим их права.
Получив жалобу правообладателя, Мосгорсуд рассматривает ее в оперативном порядке и выносит определение о прекращении нарушения прав заявителя на данном ресурсе. После этого Роскомнадзор предоставляет ресурсы три дня на удаление спорного контента, в противном случае сайт попадает в Реестр запрещенных сайтов.
В России впервые пожизненно заблокирован интернет-ресурс, размещающий пиратские копии ПО
Со своей стороны, правообладатель обязан в течение двух недель подать полноценный иск в Мосгорсуд против данного ресурса. Согласно расширенной редакции «антипиратского» закона, если один и тот же правообладатель выиграл два иска к одному и тому же ресурсы, то доступ к нему блокируется на постоянной основе.
В отличие от блокировки на основе определения, которая может быть отменена Роскомнадзрором в случае прекращения нарушения авторских прав на данном ресурсе, постоянная блокировка на основе решения Мосгорсуда отмене не подлежит.
«1С» — первые по борьбе с пиратами
«1С» была первой ИТ-компанией, воспользовавшейся год назад возможностями «антипиратского» закона: она подавала жалобу на тот же трекер dark-os.com. Всего с того момента «1С» подала в Мосгорсуд семь жалоб на различные торрент-трекеры, включая torrentino.com, torrents.com, alltorrents.net и russ-tracker.ru.
Теперь же «1С» стала первой ИТ-компанией, добившейся блокировки доступа к пиратскому ресурсу на постоянной основе. Кроме нее есть еще несколько владельцев прав на ПО, которые преследуют пиратов по аналогичной процедуре.
Так, по жалобе интернет-магазина Softkey Мосгорсуд блокировал доступ к французскому файлообменному хостингу dl.free.fr. Причиной стало размещение на данном хостинге программы Reg Orginizer, предназначенной для работы с реестром Windows. Эксклюзивные права на распространение данной программы принадлежат Sofkey.
Ранее компания «Эргосоло» судилась с торрент-трекерами, незаконно размещающими созданную известным психологом Владимиром Шахиджаняном программу «Соло на клавиатуре», предназначенную для обучения ускоренному ввода текстов.
Игорь Королев
Книг ужасов vk epub
Книг ужасов vk epub если вы хотите отправиться в путешествие и окунуться в мир страха, то приобретите книги ужасов vk epub себе несколько бесплатных страшных историй прямо сейчас. Книга состоит из более чем 1100 страниц в бумажном виде. Английские книги, английские романы и рассказы. Взятые вместе, лучшие книги ужасов были немного более интроспективными, чем в прошлом году, поражали сердце и приносили нам сокровенные страхи, от психологически впечатляющего дома ужасов Скотта Томаса в Кейл-Крик до грубой ярости и горя на центр Пола Корнелла.Джеймс Максвелл «Фэнтези-драконы» из серии «Сдвиг приливов». Это совершенно другая обстановка, чем ее предыдущие романы, и путешествие по Африке стоит того, чтобы ее прочитать. Дэн алаторре темное намерение: бесплатная электронная книга ужасов дан альаторре книги ужасов вк epub темное намерение (дан альаторре темные пассажи, книга 3) Дэна альаторре: темные сказки из США сегодня автор бестселлеров дан алаторре. Вы подписались на страшилки уличных ужасов! Скачайте бесплатно классические книги ужасов. Прошел еще один год, принесший нам ужасную массу новых книг ужасов, наводящих ужас тихими ночами.Я принимаю файлы cookie.
Pdfland делится ссылками для скачивания на бесплатные книги в формате pdf и бесплатные электронные книги, которые доступны в Интернете без каких-либо жалоб, например, на материалы, являющиеся общественным достоянием. Скачивайте новые книги. Доступны все жанры литературы. Книги помогают нам узнавать новую, полезную и нужную информацию, используя весь свой умственный потенциал. Книги, разложенные как epubvk: все сразу — Катрина Лено, сопротивляющаяся королева Сара Бет Дерст, заслуживающая внимания Райли Редгейт, Путеводитель Гренделя t. Откройте для себя бесплатные книги независимых авторов, которые публикуются на epub: романы, триллеры, стихи, книги ужасов vk epub fantasy.
Epub файл epub, 497 кб файл cora reilly — витая гордость (книга 3). При выпуске новых книг мы будем взимать с вашего метода оплаты по умолчанию самую низкую цену, доступную в период предварительного заказа. Когда я читал, я мог представить себе мрачную местность, я мог слышать рычание львов по ночам и ощущать непреодолимое зноя ужасов. Драма бесплатно группа фантастика книги ужасов vk epub 1. Книги разложены как книги-вконтакте: мишень на наших спинах от j. Мы используем файлы cookie, чтобы вам было удобнее работать в Интернете.Используйте такие функции, как закладки, заметки и выделение во время чтения «Лес самоубийц»: психологический ужастик (книга 1 о самых страшных местах в мире). Паб — читайте книги онлайн бесплатно и скачивайте электронные книги. A↭ фантастика↭ амазонка↭ магия⇝ золотой век открытие странного ужаса книги вк epub книги ужасов vk epub и превосходный военный корабль отправляет диона, младшего сына короля ксантоса, и хлою, фалезианскую принцессу, в путешествие по морю , где им противостоит королевство, гораздо более могущественное, чем они могли себе представить.Скачать книги ужасов готики бесплатно. Дархауэр, демоническая милость Ребекки Занетти, мы не должны быть Ви Киландом, мальчиком, с которым я выросла.
Пожалуйста, прочтите закрепленные правила книги ужасов vk epub внизу 4. Действие происходит во время гражданской войны в США. Это история Пейтона Фаркуара, сторонника конфедерации, приговоренного к смерти через повешение на мосту через Совиный ручей. Выбор капитана — kindle edition от Powell, вк. Сотни книг ужасов vk epub годами книги были одним из самых популярных развлечений и увлечений человечества.Если у вас возникли проблемы с загрузкой книг ужасов vk epub или какая-либо из ссылок не работает, свяжитесь с нами, и мы поможем вам получить желаемую электронную книгу. Выбор капитана — kindle edition от Powell, вк. Вы можете отменить подписку в любое время и сохранить свои бесплатные электронные книги навсегда. Художественная литература ужасов — это художественная литература в любой среде, предназначенная для того, чтобы напугать, расстроить или ужаснуть публику.
Электронная книга ужасов: новые выпуски и популярные книги, скачать электронную книгу в формате epub, mobi, azw3, pdf.Включает полный набор книг ужасов гарри поттера, книги ужасов vk epub серии epub, пятьдесят книг ужасов vk epub shades series, и множество книг ужасов vk epub популярных романов.Он безумно популярен среди заядлых читателей и имеет все самые продаваемые названия. Загрузите hp lovecraft’s the dunwich horror для своего kindle, планшета, ipad, ПК или мобильного телефона. Электронные книги — категория: ужасы — скачайте электронные книги бесплатно или читайте онлайн бесплатно. Это была двадцать вторая книга, написанная королем и опубликованная во всем мире издательством викингов. Купить kindle kindle ebooks kindle неограниченное количество лучших бестселлеров для чтения и многое другое kindle book предложения kindle singles газетный киоск управление контентом и устройствами расширенный поиск 1-16 из более 60 000 результатов для kindle store: kindle электронные книги: литература и художественная литература: ужас.
Файл cora reilly — искаженные эмоции (книга 2). Происшествие на мосту Совиного ручья. Большой выбор и множество других категорий на выбор. Ссылка в Telegram: me / ilbylb. Книга была выпущена во всем мире в 1986 году. Групповые файлы: epub, pdf, cbz, cbr, и мы не публикуем аудиокниги. Ужасы — это все о темных сторонах жизни, и вы обнаружите, что они бывают самых разных оттенков. Загрузите epub по фаренгейту 451 снизу и начните читать его сегодня же. 35 классических страшилок, скачать бесплатно 1.Есть причина, по которой их не часто называют ужасом, возможно, чтобы сохранить этот элемент неожиданности, чтобы застать вас врасплох и сбросить со стула.
71 ec ужастик / призрак страха / перепечатка дубликатов / сказки из склепа представляет собой призрак страха 003 (r) книг ужасов vk epub 019 — включая странную фантазию 018. Centsless books настоятельно рекомендует подписаться на бесплатную пробную версию слышимого. Загрузите его один раз и прочтите на своем устройстве Kindle, ПК, телефоне или планшете. Книга разделена на три раздела или главы, как вы можете сказать.Epub файл epub, 478 кб 79 1 10. Книги для всех любителей чтения. Аннигиляция — Джефф Вандермейр Натали Портман играет биолога, чей муж возвращается с секретной миссии в изолированной зоне, называемой мерцанием, таинственным растущим пузырем, захватывающим книги ужасов vk epub на юге США. Исторически причиной «ужасов» переживания книг ужасов vk epub часто было вторжение сверхъестественного элемента в повседневный человеческий опыт.
20 поистине устрашающих книг, проникающих в вашу душу во многих неожиданных направлениях.Лес самоубийц: психологический хоррор (книга 1 о самых страшных местах мира) — книги ужасов вк epub kindle edition by bates, jeremy. Для всех книг ужасов vk epub книги ужасов с более чем 50 000 оценок смотрите: самый популярный хоррор на goodreads оценка общая оценка книги основывается на нескольких факторах, включая количество людей, проголосовавших за нее, и степень ужаса книги вк епуб эти избиратели оценили книгу. Откройте для себя новых авторов и их книги в нашем сообществе электронных книг. Здесь я буду размещать в основном фэнтези, книги ужасов vk epub мистический триллер, да, современник и романтику, так что следите за страницей, если это ваша жемчужина.Что касается книг ужасов, то жанр ужасов — это все, что заставляет вас дрожать или вызывает определенное нервное чувство при подъеме по темной лестнице в постель. Скачать фильм ужасов Данвича бесплатно в формате pdf и epub. Используйте такие функции, как закладки, заметки и выделение во время чтения, выбранного капитаном.
Джанет еванович — книги ужасов vk epub stephanie plum series аудиокниги — часть 3 stephanie plum — охотница за головами с мироощущением. Все форматы доступны для ПК, Mac, электронных книг и других мобильных устройств.Скачать книги эротики бесплатно. Загрузите его в формате epub и pdf по приведенным ниже ссылкам для скачивания и начните читать это потрясающее. Небольшое преувеличение: эссе адама загаевски новый сборник эссе известного польского поэта для адама загаевского — одного из великих поэтов Польши охарактеризован как его «беспокойный и насмешливый поиск самопознания». Лучшие книги по фильмам. Epubmania — это бесплатный книжный онлайн-магазин, откуда вы можете бесплатно скачать популярные романы, книги, книги ужасов vk, рассказы и комиксы в формате epub.
Одинокий домовладелец встречает новых соседей бурной ночью, когда отключается электричество, но соседи не такие, как он ожидал. Мы сделаем предварительный заказ на ваши товары в течение 24 часов с момента их поступления. Это книги ужасов vk epub сообщество, посвященное всем любителям книг, которые ищут свое следующее прочтение. Vk fourstone — откройте для себя их книги и больше о них прямо здесь, в бесплатных электронных книгах. У нас есть фантастический выбор книг ужасов и сверхъестественного, которые можно скачать на obooko, которые гарантированно будут держать вас в напряжении, а волосы на спине ваших книг ужасов vk epub встанут дыбом.
Автор Амвросий Бирс. Именно при чтении развивает воображение, грамотность, ужасы книги vk epub логическое и творческое мышление. Мы публикуем новые выпуски и списки книг. Когда в i horror books vk epub вы были от amber garza, вы встречаетесь с роковым влечением в этом бессмысленном психологическом триллере о растущей одержимости одинокой пустышки молодой матерью, носящей ее имя. Используя наш веб-сайт, вы соглашаетесь на использование файлов cookie в соответствии с нашей политикой использования файлов cookie. По мнению Стефани, токсичные отходы, бешеные водители, вооруженные шизофреники и книги ужасов vk epub августейшая жара, влажность и углеводороды — все это часть великого приключения жизни в майке.Описание и обзор epub по Фаренгейту 451: роман под названием 451 по Фаренгейту — прекрасный роман, написанный безупречно написанным и заставляющий читателей перелистывать страницы от начала до конца. Vk всегда была незаурядным рассказчиком, и лихорадка усиливала ее растущий талант.
gabriela-alatorre.com | Мошенничество? | Отзывы и жалобы пользователей | Получить возврат | Рейтинг сайта 5%
Габриэла-алаторре.com зарегистрировали доменное имя своих веб-сайтов у регистратора доменных имен, который, как сообщается, является излюбленным местом для покупки доменных имен веб-сайтов для спама и мошенничества.
Gabriela-alatorre.com было впервые зарегистрировано в качестве доменного имени менее года назад. Это не обязательно означает что-то негативное, но стоит принять во внимание.
Габриэла-алаторре.com имеет сертификат SSL, но это не гарантирует, что Gabriela-alatorre.com является законным веб-сайтом.
Вы должны совершать онлайн-покупки только на веб-сайтах, у которых есть сертификат SSL (в адресной строке отображается замок).
Отчет о доверии домена для Gabriela-alatorre.com:
IP-АДРЕС: | 185.107.56.57 |
HOSTED IN: | Нидерланды |
РЕГИОН: | Европа |
Gabriela -alatorre.com был впервые зарегистрирован 54 дня назад.
Возраст домена: Недавно создан
Статус поиска вирусов McAfee: Непроверено
Alexa рейтинг глобального веб-сайта для Gabriela-alatorre.com: | 0 |
Посетители веб-сайта: Низкие
Проверка dyna.spamrats.com, 1 из 5 … ✔
Проверка dnsbl.spfbl.net, 2 из 5 … ✔
Проверяющий убл.unsubscore.com, 3 из 5 … ✔
Проверка zen.spamhaus.org, 4 из 5 … ✔
Проверка b.barracudacentral.org, 5 из 5 … ✔
Сервер Gabriela-alatorre.com внесен в 0 из 5 общедоступных черных списков спама.
Уровень доверия: 5%
Gabriela-alatorre.com получил Посредственный рейтинг доверия 5%.Проверьте информацию о владельце и регистрации на Gabriela-alatorre.com, нажав здесь
Если вам нужна помощь в получении возмещения от Габриэлы-алаторре.com нажмите здесь
Просто помните старую пословицу, когда думаете о покупке товаров или инвестировании: «Если это звучит слишком хорошо, чтобы быть правдой, то, вероятно, так оно и есть».Наши оценки доверия рассчитываются с помощью сложного алгоритма с использованием отзывов пользователей и данных WHOIS, которые помогают определить уровень доверия к веб-сайту.
Имейте в виду, что любые созданные пользователями обзоры и / или комментарии, размещенные на этом веб-сайте его пользователями, могут быть или не быть фактическими, как и на любом другом веб-сайте онлайн-обзоров.
Результаты рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования фазы 3 COV-BARRIER в параллельных группах
% PDF-1.7 % 1 0 объект > / Метаданные 4 0 R / Страницы 2 0 R / StructTreeRoot 3 0 R / Тип / Каталог / Viewer Настройки 5 0 R >> эндобдж 4 0 obj > поток Microsoft® Word для приложения Microsoft 365 / pdf
Один подозреваемый арестован, а другой все еще находится на свободе после стрельбы в баре Канзас-Сити
Один подозреваемый был арестован, а другой все еще находится на свободе более 30 часов после того, как пара якобы подстрелила бар Канзас-Сити, убив четырех человек и ранив еще пятерых.
Хавьер Алаторе, 23 года, был арестован поздно вечером в воскресенье в Канзас-Сити, штат Миссури.
По состоянию на раннее утро понедельника полиция все еще разыскивает 29-летнего Уго Вильянуэва-Моралеса, которого считают «вооруженным и опасным».
Оба мужчины были обвинены по четырем пунктам обвинения в убийстве первой степени, и их залог был установлен в размере 1 миллиона долларов.
Один из мужчин, по-видимому, поссорился с барменом в баре Tequila KC в субботу вечером и вернулся за полчаса до закрытия с другим мужчиной, оба из которых были вооружены пистолетами, согласно показаниям полиции и свидетелей.
Бармен сказал, что вышибала из бара в ту ночь не пришел на работу.
Хавьер Алаторе, 23 года, (слева) был арестован поздно вечером в воскресенье в Канзас-Сити, штат Миссури. Полиция все еще разыскивает 29-летнего Уго Вильянуэва-Моралеса (справа)
Полиция опубликовала зернистые фотографии обоих подозреваемых, входивших в бар Tequila KC, прежде чем они якобы открыли огонь внутри заведения, в результате чего четыре человека были убиты и пятеро ранены.
Один из мужчин, по-видимому, поссорился с барменом в баре Tequila KC в субботу вечером и вернулся за полчаса до закрытия с другим мужчиной, у обоих были пистолеты, согласно показаниям полиции и свидетелей
Один из подозреваемых виден на фотографии наблюдения, опубликованной полицией
На фотографиях наблюдения оба подозреваемых были одеты в бейсбольные майки.
Детективы просматривали видео наблюдения и опрашивали свидетелей в воскресенье утром
В маленьком баре в 1 раздалась стрельба.В 30 часов утра около 40 посетителей бегут к выходу, а раненые оставляют за собой кровавые следы.
Офицеры прибыли на место происшествия в течение нескольких минут и обнаружили четырех человек мертвыми.
Они не разглашают имена погибших — одному за 50, одному за 30 и двум примерно за 20.
Члены семьи опознали 29-летнего Альфредо Кальдерона как одну из жертв.
«Мы просто в шоке и недоверии», — сказал дядя Кальдерона Хуан Рамирес газете Kansas City Star.
«Я никому этого не желаю».
Кальдерон оставляет после себя шестилетнего сына и четырехлетнюю дочь.
Томашич сказал, что все четверо убитых были латиноамериканцами, но полиция не считает, что стрельба была совершена на расовой почве.
Детективы просматривают записи видеонаблюдения и разговаривают со свидетелями, чтобы определить, что произошло внутри бара.
«Несмотря на то, что они были там, у всех была своя история», — сказал Томашич.
«Мы думаем, что, наверное, что-то случилось в баре раньше.К сожалению, они ушли и решили перейти на другой уровень, вернулись и начали снимать.
«Это довольно маленький бар, поэтому, если к вам приходят двое парней и начинают стрелять, люди просто бегут, бегут куда угодно».
В маленьком баре в 1:30 утра в воскресенье разразилась стрельба, из-за чего около 40 посетителей бросились к выходу. Офицеры прибыли на место в течение нескольких минут и обнаружили мертвыми четырех человек
Члены семьи опознали 29-летнего Альфредо Кальдерона (вверху) как одну из жертв
Дядя Кальдерона Хуан Рамирес подтвердил, что 29-летний мужчина был одним из четырех человек, убитых в результате стрельбы.Он сказал, что Кальдерон (слева и справа) оставил после себя шестилетнего сына и четырехлетнюю дочь
.Майкл Барахас-младший (справа) получил ранение в лопатку. Он был одним из пяти раненых
Бармен Хосе Вальдес сказал KC Star, что он отказался обслужить одного из подозреваемых за несколько часов до стрельбы, потому что этот человек ранее создавал проблемы в баре.
Вальдес сказал, что этот человек бросил в него чашку и ушел, но вернулся позже с другим мужчиной незадолго до закрытия.
Он сказал, что огонь заполнил бар дымом, и он остался бояться, что здание «обвалится».
Барахас-младший (на фото) сказал, что оглядывался вокруг бара, пытаясь увидеть, откуда исходили пули, когда одна попала в него
Выстрелы заставили около 40 человек внутри броситься к выходу, поскольку раненые оставляли за собой кровавые следы.
«Я не знаю, что с этим делать. Печальный день для всех, кто потерял свои жизни и свои семьи, — сказал Вальдес, сдерживая слезы.
«Как можно зайти в место, где полно людей, и просто начать стрелять?»
Майкл Барахас-младший, 31 год, также был в Tequila KC, когда произошла стрельба.
«Они улетели так быстро, что я не подумал, что это выстрелы», — сказал Барахас-младший KC Star.
Он осматривал комнату, пытаясь увидеть, откуда исходят пули, когда одна попала ему в лопатку.
«Я чувствую, что должен был двигаться немного быстрее, но был шок», — сказал он.
Барахас-младший выбежал из бара и написал своей невесте: «В меня стреляли», прежде чем увидел, как полиция скрывается с места происшествия.
Он и еще четверо раненых посетителей доставлены в больницу в стабильном состоянии.
По крайней мере двое из них были освобождены.
Бармен Хосе Вальдес сказал KC Star, что отказался обслуживать одного из подозреваемых за несколько часов до стрельбы, потому что этот человек ранее создавал проблемы в баре
Владелец Tequila Bar KC сказал, что охранник должен был дежурить у двери, но не явился на работу в субботу вечером
Несколько человек на месте происшествия в воскресенье утром описали бар как излюбленное местное место отдыха
Воскресное утро близкие собрались возле бара, цепляясь друг за друга и плача, когда пожарные сливали кровь с тротуара.
36-летняя Тони Масиэль сказала KC Star, что она знала, что семь из девяти человек застрелили.
Она повторила рассказ Вальдеса, сказав, что один из стрелков заранее поссорился в баре.
«Он ушел, потому что его как бы выгнали, но он не ушел. Он был настойчив, — сказал Масиэль.
«Чтобы выгнать его, потребовалось около четырех человек. После этого, может быть, через час или два он вернулся, и это случилось. Он был не один. С ним был еще кто-то.’
Масиэль сказала, что знает жену одного из предполагаемых стрелков. Она утверждала, что он проявил насилие по отношению к своей жене во время караоке в прошлый четверг.
Она выразила надежду, что боевики будут задержаны в ближайшее время.
«Эти люди не знают, что они сделали», — сказал Масиэль. «Они взяли брата, отца, сына, кого-нибудь. Это неправильно ».
Шей Селедон сказала, что была в баре с друзьями, когда один из двух подозреваемых в стрельбе начал драку.
Селедон сказал KC Star, что мужчина кричал и выглядел в состоянии алкогольного опьянения.
Через несколько часов она узнала, что этот человек и его сообщник застрелили жениха ее подруги.
Она сказала, что подруга надавила на рану ее жениха и сделала ему искусственное дыхание, пытаясь спасти жизнь.
«Она держала мужа до последнего вздоха», — сказал Селедон.
Один из родственников Селедона получил огнестрельное ранение в ключицу, но, как ожидается, выживет.
Несколько человек собрались возле места происшествия в воскресенье утром, пока полиция проводила расследование.
Коронер загружает одно из тел в белый фургон возле бара
Несколько человек на месте происшествия в воскресенье утром описали Tequila KC как любимую местную горячую точку.
«Можно сказать, это был дом вдали от дома, — сказал Масиэль. «Но после этого я не знаю, что будет с нашим сообществом».
Вальдес сказал, что трое из убитых были завсегдатаями, родители которых также часто бывали в баре, а четвертая жертва была там впервые.
«Мы потеряли несколько хороших людей, молодых людей», — сказал Вальдес.
Бдение по погибшим назначено на 19:00 в воскресенье.
Томашич сказал, что Tequila KC — это частное заведение только для членов клуба, но владелец сообщил местным СМИ, что он стал публичным после того, как некоторое время назад изменил свое название.
Бар расположен в районе, где проживают преимущественно латиноамериканцы, на юго-западе Канзас-Сити.
Владелец сказал, что охранник должен был дежурить у двери, но не пришел на работу в субботу вечером.
Текила KC (на фото) находится в районе, где проживают преимущественно латиноамериканцы, на юго-западе Канзас-Сити.
На двери бара возле 10-й улицы и Центральной авеню висит знак, запрещающий огнестрельное оружие
Мэр Канзас-Сити Дэвид Алви кратко обратился к средствам массовой информации возле места происшествия в воскресенье утром.
«Это печальный день для всех, кто причастен к этому», — сказал Алви.
«Предприятия и семьи, которые живут в этих районах, растут в нашем сообществе, и они заслуживают того, чтобы чувствовать себя в безопасности в своих районах.
«Их бизнес заслуживает защиты, и наше полицейское управление действительно проделало выдающуюся работу по работе с местным сообществом, чтобы выявить проблемы и найти решения».
Губернатор Канзаса Лаура Келли написала в Твиттере: «Я думаю о жертвах, их семьях и друзьях после массового расстрела ранним утром в Канзас-Сити, штат Канзас.В результате трагедии четыре человека погибли и еще пятеро получили ранения. Мы внимательно следим за ситуацией с помощью местных правоохранительных органов ».
Представитель Шарис Дэвидс, демократ, представляющая район, где произошла стрельба, написала в Твиттере, что ее «сердце разбивается из-за всех, кто пострадал».
Новости о стрельбе — которая является 324-й в этом году, согласно архиву Gun Violence Archive — была встречена бесчисленными призывами к реформе оружия в социальных сетях.
Знаете кого-нибудь из жертв этой стрельбы? Свяжитесь с меган.листов@mailonline.com.
Усовершенствованная недорогая гидропонная система для выращивания арабидопсиса и других видов растений в асептических условиях | BMC Plant Biology
Описание гидропонной системы
Мы улучшили ранее описанную гидропонную систему, состоящую из стеклянного сосуда и элемента из нержавеющей стали, объединенного проволочной сеткой, закрепленной между двумя плоскими кольцами и удерживаемой на месте тремя ножками [8], с помощью более простой и дешевой системы, состоящей из сосуда из полиэтилена и держателя семян, объединенного сеткой из полиэтилена высокой плотности круглой формы и двумя кольцами из полиэтилена (рисунок 1A, B; таблица 1).Используемые здесь сосуды и сетка легко доступны на местных рынках; сосуды на самом деле представляют собой контейнеры для пищевых продуктов (Microgourmet®, Solo Cup, США, http://www.solocup.com), доступные в магазинах пищевых упаковок, в то время как сетка из полиэтилена высокой плотности представляет собой кусок сетки от тли, приобретенный в местных магазинах, поставляющих тепличные принадлежности (http : //www.textilesagricolas.mx). Небольшое заполненное хлопковой пробкой отверстие в крышке контейнера позволяет газообмену в системе (рис. 1C). Этот вентиляционный фильтр снижает, но не устраняет высокую влажность в контейнере со средой.Эту проблему можно решить, добавив больше вентиляционных фильтров или используя другие герметизирующие материалы, например, бумажную ленту Micropore 3 M®. Для нашей гидропонной системы не требуется аэрация жидкой среды. При использовании небольших резервуаров в качестве средних контейнеров отрицательного воздействия на рост растений не наблюдалось (ссылки в таблице 1).
Рисунок 1Гидропонная система: размеры и сборка компонентов. A и B) Размеры и сборка держателя семян. C) Гидропонная система в сборе.Показаны емкости с разным объемом для жидких сред. Цифры в нижней части контейнера указывают максимальный объем, а число внутри контейнера — объем жидкой среды, используемой в каждом случае.
Таблица 1 Сравнение между ранее описанными гидропонными системами и предлагаемой здесь системойНовый держатель семян для размещения семян поверх жидкой среды состоит из сетки из моноволокон HDPE, удерживаемых между двумя кольцами PE (кольцо A и B), с площадью 78.54 см 2 (диаметр = 10 см), который способен удерживать от 50 до 65 проростков Arabidopsis в течение 10–15 дней после прорастания (Рисунок 1A, B; Рисунок 2) (Таблица 1). Полностью развитые растения арабидопсиса (2–3 растения на сосуд) также можно выращивать в этой системе, если крышку контейнера заменить другим контейнером из полиэтилена (дополнительный файл 1). Сетка против тли с размером отверстия 0,75 мм на 0,75 мм (размер ячейки обычно называется 25 × 25) достаточна для хранения семян Arabidopsis поверх сетки (Рисунок 2A, B) и обеспечения независимого развития корневой системы (Рисунок 2C, D, E).Сетка против тли или насекомых с более низкой плотностью может быть полезна для семян большего размера, чем семена арабидопсиса. В нашей гидропонной системе не требуются ножки для поддержки держателя сетки. Держатель семян просто помещается в контейнер и удерживается на месте, прижимаясь к стенкам контейнера. В отличие от других протоколов, о которых сообщалось ранее (таблица 1), размер контейнера описываемой здесь системы может варьироваться в зависимости от требуемого объема среды (рисунок 1C). Однако тот же стандартный держатель семян можно использовать для контейнеров на 1000 мл, 750 мл или 500 мл, обеспечивая эффективный объем для роста корней 600 мл, 350 мл и 210 мл соответственно (рис. 1C).
Рис. 2Саженцы арабидопсиса, растущие в рамках предложенной гидропонной системы. А) Семян высевается на семенной держатель сетки. Показано крупное изображение одного семени (вставка). B-E) Саженцы, растущие в нашей гидропонной системе. Сверху (B) и вид сбоку (C) 12-дневных сеянцев. Сверху (D) и вид сбоку (E) трехнедельных сеянцев.
Наша гидропонная система может использоваться для выращивания других модельных видов в асептических условиях. Solanum lycopersicum , Nicotiana tabacum, и Семена Setaria viridis стерилизовали и высевали непосредственно на сетку. У всех видов через две недели после прорастания наблюдался адекватный рост побегов и корневой системы (рис. 3).
Рисунок 3Предлагаемая гидропонная система может использоваться с другими модельными однодольными и двудольными растениями. Вид сбоку и сверху на рост корней и побегов S. lycopersicum , N. tabacum и S.viridis в возрасте 2–3 недель.
Другие преимущества этой гидропонной системы связаны с переносом растений и сбором растительных тканей. В обоих случаях требуется только предварительно простерилизованный зажим для перевязочной ткани (6 или 12 дюймов), чтобы вытащить держатель семян и поместить его в новую среду (рис. 4A) или погрузить в контейнер с жидким азотом для сбора тканей. (Рисунок 4B). Сбор корней молодых проростков гидропонной системы также проще и требует меньше времени, чем сбор корней из проростков, выращенных в агаризованной среде.При извлечении держателя семян из контейнера молодые корни прилипают к сетке, их можно промокнуть впитывающим бумажным полотенцем и немедленно заморозить в жидком азоте. Биомассу побегов также можно легко отделить от сетки с помощью скальпеля, а затем сетку с прикрепленными корнями можно обработать отдельно.
Рисунок 4С помощью этой гидропонной системы можно легко и быстро перейти на новую питательную среду и / или собрать корень. A) Саженцы табака передаются только с держателем семян. B) Партия саженцев табака, выращиваемых на семяпроводе, замороженных в жидком азоте.
Протокол настройки гидропонной системы
Пошаговые инструкции по настройке гидропонной системы приведены в следующем разделе и в Дополнительном файле 2. Также указаны советы и важные примечания.
- 1.
Получение нейлоновой сетки (см. Рисунок 1A)
Приобретите кусок сетки от тли или насекомых.Нарисуйте круг (диаметром 10 см) маркером и картонным шаблоном. Обрежьте круг вилкой. Споткнув круг, удалите цветные следы на сетке, используя абсолютный спирт. Промойте сетку под проточной водой (вариант: используйте деионизированную воду). Высушите на бумажных полотенцах. Совет: используйте для рисования маркер красного цвета. Красный цвет чистить легче, чем другие цвета.
- 2.
Изготовление держателя сетки (см. Рисунок 1A, B)
Разрежьте дно полиэтиленового контейнера объемом 500 мл.Используйте лезвие скальпеля. Оставьте небольшой край (шириной 0,5 см). На этот край наденет сетчатый круг. Для кольца А оставьте высоту 2,5 см, для кольца Б оставьте 3 см. Совет: используйте лезвие скальпеля с прямым наконечником, чтобы легко разрезать дно контейнера.
- 3.
Подготовка крышки контейнера
Найдите центр крышки контейнера и отметьте его.Просверлите центр крышки. Закройте небольшое отверстие в крышке ватным тампоном. Совет: горячим гвоздем растопите отверстие в крышке, чтобы не было заусенцев.
- 4.
Стерилизация
Контейнер, кольца и сетку необходимо стерилизовать отдельно в автоклаве (121 ° C и давление 15 psi в течение 20 минут). Поместите контейнер, кольцо и сетку в полиэтиленовые пакеты.Для контейнеров и колец закройте полиэтиленовые пакеты, но не запечатывайте их. В таком случае колебания давления во время стерилизации могут повредить их. Важный момент: переведите автоклав в режим жидких сред. Совет: после стерилизации поместите полиэтиленовые пакеты в другой, чтобы снизить риск заражения.
- 5.
Сборка гидропонной системы (см. Рисунок 1C)
Откройте стерилизованные полиэтиленовые пакеты с контейнерами, кольцами, сетками и крышками.Налейте в емкость объем предварительно простерилизованной жидкой среды. Совет: использование жидких сред при комнатной температуре снижает образование конденсата пара на крышке и стенках емкости. Возьмите кольцо B с помощью пинцета для перевязочной ткани и поместите его в емкость чуть выше уровня жидкой среды. Наденьте кусок сетки на кольцо B, медленно поднимите его, а затем верните на кольцо, избегая образования пузырей. Установите кольцо А на сетку. Совет: если кольцо А трудно надеть на сетку, быстро нагрейте кольцо с помощью горелки Бунзена.Наконец, закройте контейнер.
Применение нашей гидропонной системы: 1) Быстрые транскрипционные реакции на голодание по Pi
В этом исследовании были проанализированы применения этой новой гидропонной системы культивирования для модельных растений. Изменения во время голодания по Pi на уровне транскрипции, связанные с модификациями RSA Arabidopsis, были описаны ранее [13]. Здесь сначала мы сравнили влияние доступности Pi на RSA и профили экспрессии восьми маркерных генов дефицита Pi в проростках Arabidopsis, выращенных в гидропонике, по сравнению с агаровой средой.Затем, пользуясь преимуществом короткого времени, которое требуется с этой новой гидропонной системой для переноса растений в различные среды, ранние транскрипционные ответы на истощение Pi были исследованы на уровне всего генома; такие ответы ранее не оценивались.
Гены Arabidopsis, чувствительные к росту и истощению Pi, на гидропонных средах с недостатком Pi сообщалось ранее [14, 15].К 12 дню после прорастания проростки Arabidopsis, выращенные на гидропонике, производили более высокую биомассу побегов и корней, чем проростки, выращенные на твердой среде (рис. 5A, B), что согласуется с предыдущими сравнениями между обоими методами выращивания Arabidopsis [5]. Типичное увеличение накопления биомассы корней при стрессе Pi наблюдалось у проростков, выращенных в агаризованной среде, однако такое изменение не было статистически значимым (Рисунок 5B). Напротив, сухой вес корней проростков, выращенных на гидропонике при стрессе Pi, составлял 2.В 25 раз выше по сравнению с показателем, наблюдаемым для проростков с достаточным количеством пи (рис. 5В). Этот более высокий рост корней при низком Pi является типичным изменением RSA, которое позволяет увеличить поглощение Pi в естественных почвенных условиях [14]. Что касается адаптации RSA к низкой доступности Pi, мы также обнаружили уменьшение длины первичного корня на 30% по сравнению с контрольной обработкой гидропоникой, в то время как такое уменьшение было выше (76%) в корнях из агаризованной среды (рис. 5C). Точно так же наблюдалось умеренное увеличение плотности боковых корней и корневых волосков при низком уровне Pi в жидких средах, тогда как заметное увеличение при тех же условиях роста Pi было обнаружено в агаризованных средах (рис. 5D, E, F).
Рисунок 5Рост растений в гидропонике или на твердой среде при контрастных режимах Pi (A-F). проростков арабидопсиса высевали непосредственно на держателе семян (50-60 семян на ячейку) или агаровой среде (30-35 семян на чашку), рост в течение 12 дней при двух различных режимах Pi (-P = 10 мкМ Pi, + P = 1,25 мМ Pi), а затем проанализировали. Столбцы представляют собой средние значения ± SE (гидропоника, биологические повторения = 5, n = 20–60; агаровая среда, биологические повторения = 10–15, n = 15). Звездочки обозначают достоверное отличие от соответствующего контроля (обработка + P) согласно t-критерию Стьюдента (P <0.05).
Хотя влияние дефицита Pi на развитие корней было более серьезным в агаризованных средах, чем в нашей гидропонной системе, типичные модификации корней, вызванные стрессом Pi (первичное укорочение корня и более высокое образование боковых корней и корневых волосков) [14], были наблюдается в обеих системах. Различия в величине изменений RSA в ответ на депривацию Pi можно объяснить вариациями в составе среды, вызванными добавлением гелеобразующих агентов, и / или легкостью доступа к Pi, доступному в используемых системах роста.Ранее было показано, что загрязнители, такие как Pi, железо и калий в гелеобразующих соединениях, могут изменять морфофизиологический и молекулярный ответ на голодание по Pi [1]. Гидропоника обеспечивает лучший контроль над составом среды и обеспечивает прямой и однородный контакт всей корневой системы с жидкой средой. Это условие могло бы улучшить усвоение питательных веществ, а при голодании по Pi облегчить резкие изменения RSA, обычно наблюдаемые в корнях проростков, выращенных в агаризованной среде.
После этого мы определили эффективность гидропонной системы для индукции экспрессии генов с низким уровнем Pi. Анализ профилей экспрессии восьми генов, участвующих в транскрипционной, метаболической и морфологической реакции на голодание по Pi, был проведен на целых проростках Arabidopsis, выращенных в гидропонных условиях с низким или высоким Pi на 4, 7, 12, 14, 17 и 21. дней. Количественная оценка уровня транскрипции факторов транскрипции (TF) PHR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1), WRKY75 (семейство TF WRKY) и bHLh42 (TF, содержащий основной домен спираль-петля-спираль) выявила прямое влияние Pi устойчивость стресса к активации этих трех молекулярных модуляторов [16-18]. WRKY75 имел самый высокий уровень экспрессии среди проанализированных ТФ со значительной индукцией экспрессии через 12 дней в условиях дефицита Pi (фиг. 6A). BHLh42 показал аналогичное увеличение экспрессии. Поскольку большинство молекулярных ответов на Pi-голодание затрагивается у мутанта phr1 , PHR1 считается главным контроллером пути передачи сигналов Pi [16, 19]. В случае PHR1 мы обнаружили, что этот ген не проявляет такой конститутивной экспрессии при дефиците Pi, как первоначально сообщалось [16].Вместо этого профиль экспрессии этого главного регулятора в корнях показал чувствительность к условиям с низким уровнем Pi (фиг. 6A). Эти данные согласуются с низкой индукцией транскрипции PHR1 , ранее наблюдаемой в побегах Arabidopsis [20]. LPR1 (НИЗКИЙ ФОСФАТ 1) и PDR2 (ОТВЕТ НА ДЕФИЦИТ ФОСФАТА 2) , два гена, участвующие в росте корневой меристемы [21], и конъюгаза убиквитина E2. load [22], показал заметное увеличение экспрессии через 14 дней лечения (рис. 6A).Напротив, SPX1 (ген, кодирующий белок с доменом SYG1 / Pho81 / XPHR1) и PLDZ2 (PHOSPHOLIPASE DZ2) , два типичных маркерных гена дефицита Pi, участвующих в передаче сигналов и рециклинге Pi [23, 24] соответственно, показали значительную индукцию, начиная с четвертого дня. И SPX1 , и PLDZ2 , но особенно SPX1 , имели заметное увеличение уровня экспрессии (рис. 6B). Анализ экспрессии этих Pi-чувствительных генов вместе с анализом RSA во время голодания по Pi на гидропонике демонстрирует высокую производительность нашей системы для выращивания растений и для анализа молекулярных ответов на дефицит питательных веществ.
Фигура 6qRT-PCR определение профиля экспрессии маркерных генов голодания по Pi в проростках Arabidopsis, выращенных на гидропонике. Профиль экспрессии A) модуляторов транскрипции и генов, участвующих в росте меристемы корня, и B) Передача сигналов и рециклинг Pi. Проростки арабидопсиса выращивали в течение 21 дня при двух различных режимах Pi (-P = 10 мкМ Pi, + P = 1,25 мМ Pi). РНК целых проростков экстрагировали в шести временных точках, и уровни экспрессии генов анализировали с помощью анализов qRT-PCR.Относительное количественное число (RQ) было получено из уравнения (1 + E) 2 ∆∆CT , где ∆∆CT представляет собой ∆CT (-P) –∆CT (+ P), а E — эффективность ПЦР. Значение C T ранее было нормализовано с использованием уровней экспрессии ACT2, PPR и UBHECT в качестве внутреннего стандарта. Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех биологических повторов (n = 100-150).
Изучение ранних транскрипционных ответов по всему геному на истощение Pi: обзор и функциональная классификация дифференциально экспрессируемых генов
Ранние транскрипционные ответы на доступность Pi на уровне всего генома (от 4 до <12 часов) были ранее определены у всего Arabidopsis всходы с использованием микрочиповых платформ [25, 26].Важным экспериментальным условием в этих исследованиях было использование 100–200 мкМ в качестве низкой концентрации Pi, считающейся достаточной для поддержания накопления биомассы, но не для индукции чрезмерного накопления Pi [26]. Сообщалось, что проростки арабидопсиса, растущие при 100 мкМ Pi в агаризованной среде, имели такие же эндогенный фосфор (P), продукцию биомассы и RSA, что и проростки, растущие при 1 мМ Pi [14]. В жидких средах 200 мкМ Pi также рассматривается как достаточное для Pi условие для выращивания однодольных растений, таких как кукуруза [27].Мы обнаружили, что проростки арабидопсиса, выращенные с 250 мкМ Pi в жидкой среде, не способны индуцировать экспрессию AtPT2 / AtPHT1; 4 ( PHOSPHATE TRANSPORTER 2 ), высокоаффинного переносчика Pi, реагирующего на голодание по Pi, обзор которого приведен в [28]. как показал анализ проростков арабидопсиса, несущих транскрипционный репортер AtPT2 :: GUS. Сеянцы, растущие в гидропонике в течение 12 дней, показали нулевую экспрессию репортера ни в побеге, ни в корне. Когда эти проростки были перенесены в среду с истощенной Pi, репортер AtPT2 :: GUS был обнаружен через 12 часов после переноса (рис. 7).
Рисунок 7Паттерн экспрессии AtPT2 :: GUS при истощении Pi. проростков Arabidopsis AtPT2 :: GUS выращивали на гидропонике в течение 12 дней при достаточном уровне Pi (125 мкМ Pi), а затем переносили в жидкую среду, обедненную Pi, или контрольную среду (125 мкМ Pi, имитация). Активность GUS в листьях и корнях контролировали с помощью гистохимического анализа в разные моменты времени. Выражение GUS в ложном состоянии показано в последний раз (48 ч).
Чтобы продемонстрировать эффективность нашей системы для выявления ранних транскрипционных ответов, проростки Arabidopsis проращивали и выращивали в системе гидропоники с 125 мкМ Pi в течение 12 дней, а затем сразу же лишали Pi.Образцы были взяты в трех кратковременных точках (10 мин, 30 мин и 2 ч) (рис. 8А). Корни собирали и замораживали сразу после каждой временной точки, извлекали общую РНК и анализировали их транскриптом с помощью профилирования экспрессии микроматрицы. Для анализа данных были выявлены различия в экспрессии генов между истощенными по Pi и достаточными по Pi корнями (общий эффект доступности P), а также различия, вызванные доступностью Pi во временном взаимодействии (эффект времени × Pi). В соответствии с используемыми уровнями строгости (FDR≤ 0.05 и кратность ± 2), всего 181 ген показал дифференциальную экспрессию по крайней мере в одной из трех выбранных временных точек (см. Дополнительный файл 3). Было обнаружено, что в общей сложности 92 гена активируются и 89 подавляются за счет истощения Pi (рис. 8B). Интересно, что только 3 гена из 92 индуцированных и 1 подавленный из 89 репрессированных были общими для всех трех оцениваемых временных точек, что указывает на специфические транскрипционные ответы в зависимости от анализируемой временной точки (рис. 8B). При объединении в функциональные классификации (таблица 2 и дополнительный файл 3) некоторые из них напоминали те, о которых сообщалось ранее [25–27, 29], тем самым подтверждая нашу систему для высокопроизводительного транскрипционного анализа.Согласно профилю экспрессии гены с повышенной регуляцией были сгруппированы в шесть различных групп, тогда как только три группы были идентифицированы для репрессированных генов (дополнительный файл 3). Анализ паттернов экспрессии с помощью агломеративной иерархической кластеризации показал большое количество активируемых генов в последний оцениваемый момент времени (2 часа), в то время как противоположная тенденция наблюдалась для генов с пониженной регуляцией, которые были более чувствительны в первый момент времени (10 минут). ) (Рисунок 8C). Дифференциально экспрессируемые гены были классифицированы по функциональным категориям в соответствии с классификацией Мюнхенского информационного центра белковых последовательностей (MIPS) с использованием базы данных FunCat [30].Категории, более представленные в активированных генах, были связаны с метаболизмом, транскрипцией, метаболизмом белков и взаимодействием с окружающей средой (таблица 2). Кроме того, было аналогичное количество индуцированных и репрессированных генов в категориях метаболизма Pi, фосфолипидов и фосфолипидов, за исключением тех, которые связаны с метаболизмом гликолипидов. Интересно, что категория «Энергия» (гликолиз, глюконеогенез, пентозофосфатный путь, дыхание, преобразование и регенерация энергии и поглощение света) была представлена только в индуцированных генах (таблица 2).
Рисунок 8Ранние изменения транскриптома корней Arabidopsis при голодании по Pi. А) Рабочий процесс для экспериментов. Проростки арабидопсиса выращивали на гидропонике в течение 12 дней при достаточном уровне Pi (125 мкМ Pi), а затем переносили на жидкие среды, обедненные Pi, на короткое время. Собирали корни, выделяли РНК и анализировали транскриптом с использованием платформы олигонуклеотидных микрочипов. B) Диаграммы Эдвардса-Венна, показывающие общие или отдельные регулируемые гены в выбранных временных точках. C) Кластеризация дифференциально экспрессируемых генов. Кластеризацию проводили с использованием гладкой корреляции и кластеризации среднего сцепления в программном обеспечении GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent Technologies). Оранжевый указывает на повышенную регулировку, зеленый — на пониженную, а белый — на неизменные значения, как показано на цветовой шкале в правой части рисунка.
Таблица 2 Распределение функциональных категорий дифференциально экспрессируемых генов, отвечающих на Pi-депривацию в короткие сроки в корнях ArabidopsisРанние транскрипционные ответы на низкий уровень доступности Pi включают модификации клеточной стенки, активность белков, окислительно-восстановительные процессы и опосредованную гормонами передачу сигналов, которые предшествуют указанным путям передачи сигналов Pi.
Согласно функциональной аннотации базы данных информационных ресурсов Arabidopsis (TAIR , по адресу http: // www.arabidopsis.org), большинство генов, индуцируемых или подавляемых в течение первых 30 минут истощения Pi, связаны с составом клеточной стенки, активностью белка, окислительно-восстановительной и опосредованной гормонами передачей сигналов. Ранее известные Pi-чувствительные гены, такие как MGDG SYNTHASE 3 ( MGD3 ), SQDG SYNTHASE 2 ( SQD2 ), ФОСФАТАЗА ПУРПУРНОЙ КИСЛОТЫ 22 ( PAP22 METADEN SAM1 ) показали значительные изменения в экспрессии до последней оцененной временной точки (2 часа).Интересно, что несколько регуляторов транскрипции экспрессировались по-разному на протяжении всего эксперимента.
Через 10 минут корни Arabidopsis ответили на депривацию Pi активацией 27 генов (18,5% от общего числа), участвующих в деградации полисахаридов, отложении каллозы, биосинтезе пектина, размножении клеток и организации цитоскелета микротрубочек (см. Группу I, дополнительный файл 3). Также были представлены наборы генов, связанные с окислительно-восстановительными процессами, модификациями активности белков (убиквитинирование, миристоилирование, АТФ или связывание ионов) и передачей сигналов, опосредованной гормонами (абсцизовая кислота, жасмоновая кислота).Избыточное представительство групп в соответствии с функциональными процессами не было ясным в генах с пониженной регуляцией, за исключением генов, связанных с модификациями судьбы белков (13,5% от общего числа 44 генов).
По мере того, как истощение Pi прогрессировало (30 мин), транскрипционные изменения, связанные с клеточной стенкой, уменьшались, в то время как ответы на транспорт ионов, передачу сигналов гормонами (ауксинами, абсцизовой кислотой, салициловой кислотой) или киназами были более представлены как в индуцированных, так и в репрессированных генах (дополнительный файл 3). В генах с пониженной регуляцией эта тенденция также была обнаружена в последний момент времени (2 ч).Интересно, что через 30 минут гены, участвующие в Pi-гомеостазе, например SPX1 и GLYCEROL-3-PHOSPHATE PERMEASE 1 ( G3Pp1 ) уже были индуцированы (см. Группы IV и V, дополнительный файл 3).
Более высокое количество активируемых генов было обнаружено через два часа после истощения Pi. Большинство индуцированных генов (9 из 37 генов) были связаны с переносом ионов или гомеостазом, но также были связаны с метаболизмом углеводов, окислением-восстановлением, передачей сигналов, активностью и развитием белков.Важно отметить, что другие типичные молекулярные маркеры голодания по Pi также индуцировались в течение 2 часов. Две фосфатидатфосфатазы (PAP) (At3g52820 и At5g44020) индуцировались постепенно по мере протекания Pi-голодания. MGD3 и SQD2 , оба участвующие в рециркуляции Pi, также были индуцированы через 2 часа (см. Группу VI, дополнительный файл 3). Экспрессия этих генов вместе с SPX1 и G3Pp1 указывает на то, что классические пути трансдукции, связанные с Pi-голоданием, могут запускаться уже через два часа после воздействия на проростки среды, лишенной Pi. SPX1 сильно индуцируется голоданием по Pi и обычно классифицируется как член системного сигнального пути в зависимости от SIZ1 / PHR1, рассмотренного в [31]. Ранее сообщалось о его ранней индукции (3–12 ч) [25], однако о «немедленном-раннем ответе» в течение нескольких минут после истощения Pi пока не сообщалось. Сходным образом роль усиленной экспрессии G3Pp1 внутри путей трансдукции или метаболических перестроек, запускаемых стрессом Pi, все еще плохо изучена [25, 26].Недавняя функциональная характеристика семейства глицерофосфодиэфирфосфодиэстеразы Arabidopsis (GDPD) предполагает, что глицерин-3-фосфат (G3P) является источником Pi или фосфатидной кислоты (PA), которые могут использоваться глицерин-3-фосфатазой (GPP) или путями DGDG / SQDG [ 32]. Ранняя индуцированная экспрессия G3Pp1 , PAP22 и MGD3 согласуется с гипотезой о том, что при дефиците Pi G3P может сначала превратиться в PA двумя реакциями ацилтрансферазы, и Pi будет затем высвобождаться во время последующего превращения PA в диацилглицерин (ДАГ) посредством ПАП [32].Полученный DAG мог быть включен в DGDG или SQDG посредством MGD2 / 3 и DGD1 / 2 и SQD1 / 2, соответственно [32]. Было обнаружено, что MGD2 и MGD3 индуцированы в проростках Arabidopsis, истощенных по Pi в течение 3–12 часов [25]. Эта ранняя транскрипционная активность для генов MGD во время голодания по Pi также отражается в повышенной ферментативной активности, что обнаружено в корнях фасоли, лишенных Pi [33]. Сообщалось о повышенных уровнях PA и активности MGDG и DGDG в корнях бобов, лишенных Pi менее чем на 4 часа [31].Активация ранней генной экспрессии генов, кодирующих MGDG и DGDG, но не ферментов PLD / C, предполагает, что G3P, а не PC, являются источником биосинтеза PA и DAG для ранних путей передачи сигналов и рециклинга Pi.
Согласно нашим данным, конкретному пути трансдукции к дефициту Pi могут предшествовать общие реакции, связанные со стрессом, которые могут изменять метаболизм до запуска специфической экспрессии транскрипционных факторов. Эта идея согласуется с предыдущими отчетами об анализе истощения Pi у Arabidopsis за короткий и средний-долгий периоды времени (3–48 ч), в которых также сообщалось о дифференциально экспрессируемых генах, связанных с патогенезом, гормонально-опосредованной передачей сигналов, белковой активностью, окислительно-восстановительными процессами, переносом ионов. , и модификации клеточной стенки [25, 28, 34].Аналогичные результаты были недавно получены на проростках риса при 1-часовом голодании по Pi [35].
Применение нашей гидропонной системы: 2) Патологические анализы для оценки системных защитных реакций
Чтобы определить пригодность нашей гидропонной системы для взаимодействия арабидопсиса с патогенами, мы оценили системный эффект инокуляции корней с помощью Pseudomonas syringae pv томат штамм DC3000 ( Pst DC3000) на транскрипционную активацию патогенетического гена PR1 .Хотя P. syringae обычно известен как листовой патоген, было доказано, что он является отличным колонизатором корней арабидопсиса [36, 37]. Трансгенные проростки Arabidopsis, несущие конструкцию PR1 :: GUS , выращивали в течение 12 дней, а затем инокулировали свежим бактериальным инокулятом 0,002 OD 600 . Активность β-глюкуронидазы (GUS) анализировали гистохимическим окрашиванием через различные интервалы времени после инокуляции. Системный ответ на колонизацию корней Pst был очевиден между 2 и 6 часами после инокуляции (hai), о чем свидетельствует сильная экспрессия маркерного гена в листьях.После 24 га активность GUS распространилась по всей системе побегов, но не в корнях (рис. 9). Эти результаты демонстрируют хорошие результаты при изучении реакции растений на патогены.
Рисунок 9Паттерн экспрессии PR1 :: GUS под P. syringae pv. инкубация томатов. проростков Arabidopsis PR1 :: GUS выращивали на гидропонике и затем переносили в жидкую среду, содержащую бактерий P. syringae (конечная OD 0,002 OD 600) или контрольную среду (имитацию).Активность GUS в побегах и корнях контролировалась гистохимическим анализом в разные моменты времени. Выражение GUS в ложном состоянии показано для последней выбранной временной точки (24 часа).
Усовершенствованная недорогая гидропонная система для выращивания арабидопсиса и других видов растений в асептических условиях. Научно-исследовательский доклад по «Биологическим наукам»
Биология растений
СТАТЬЯ МЕТОДОЛОГИИ Открытый доступ
Усовершенствованная недорогая гидропонная система для выращивания арабидопсиса и других видов растений в асептических условиях
Фульхенсио Алаторре-Кобос1,2, Карлос Кальдерон-Васкес1,3, Энрике Ибарра-Лаклетт1,4, Ленин Йонг-Вильялобос1, Клаудиа-Анахи Перес-Торрес1, Арасели Оропеза-Абурто1, Альфонсо Браво Мендес-Гардес1,4 -Моралес1, Долорес Гутьеррес-Аланис1, Алехандра Чакон-Лопес1,5, Бетси-Анаид Пенья-Оканья1 и Луис Эррера-Эстрелла1 *
Аннотация
Предпосылки: Гидропоника — это система для выращивания растений, которая обеспечивает более точный контроль состава питательной среды.Сообщалось о нескольких гидропонных системах для Arabidopsis и других модельных растений. Легкость настройки системы, стоимость системы выращивания и гибкость для определения характеристик и сбора растительного материала — это особенности, которые постоянно улучшаются в новой гидропонной системе, о которой сообщается.
Результаты: Мы разработали систему гидропонного культивирования арабидопсиса и других модельных растений. Эта недорогая, качественная и новая система основана на перерабатываемых и стерилизуемых пластиковых контейнерах, которые легко доступны у местных поставщиков.Наша система позволяет проводить масштабные манипуляции с рассадой. Он приспосабливается к различным условиям выращивания и имеет расширенное окно роста до тех пор, пока не приживутся взрослые растения. Новый держатель семян также облегчает перенос и сбор рассады. Здесь мы сообщаем об использовании нашей гидропонной системы для анализа транскриптомных реакций Arabidopsis на доступность питательных веществ и взаимодействия растений / патогенов.
Выводы: Эффективность и функциональность предлагаемой нами гидропонной системы продемонстрирована в экспериментах по дефициту питательных веществ и патогенезу.Гидропонно выращенные проростки арабидопсиса в условиях длительного дефицита неорганического фосфата (Pi) показали типичные изменения в архитектуре корня и высокую экспрессию маркерных генов, участвующих в передаче сигналов и рециклинге Pi. Полногеномный транскрипционный анализ экспрессии генов корней Arabidopsis, лишенных Pi за короткие периоды времени, показывает, что гены, связанные с общим стрессом, активируются раньше, чем гены, специфичные для передачи сигналов и метаболизма Pi. Наша гидропонная система также оказалась полезной для проведения эссе патогенеза, выявляя раннюю активацию транскрипции генов, связанных с патогенезом.
Ключевые слова: гидропоника, арабидопсис, корень, фосфатное голодание, патогенез
Фон
Стандартизация условий роста — важный фактор для получения высокой воспроизводимости и значимости в экспериментальной биологии растений. В то время как освещение, влажность и температура являются факторами, которые можно эффективно контролировать с помощью камер или комнат для выращивания растений, состав среды может быть значительно изменен из-за физико-химических характеристик и элементарных примесей различных партий гелеобразователей [1,2].
* Для переписки: [email protected]
labratorio Nacionalde Genómica para la Biodiversidad (Langebio) / Unidad de Genómica Avanzada (UGA), Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN, 36500 Ирапуато, Гуанахуато, Мексика Полный список информации об авторах доступен в конце статьи
Например, на перечень изменений в архитектуре корневой системы (RSA) как на адаптацию растений к стрессу, вызванному питательными веществами, может влиять присутствие следов питательных веществ в различных марках или даже партиях агара, как указано для реакции голодания по Pi [1] .Недавно были опубликованы подробные протоколы получения реальных твердых питательных сред с дефицитом питательных веществ для нескольких макро- и микронутриентов [1,2]. Эти протоколы описывают тщательный выбор гелеобразующих агентов на основе предыдущих химических характеристик, которые увеличивают стоимость и время для проведения экспериментов. Помимо проблем, связанных с составом сред, окно роста растений сокращается в чашках Петри (максимум 2-3 недели) [3]. Время культивирования in vitro можно увеличить, используя стеклянные сосуды
.O © 2014 Alatorre-Cobos et al.; лицензиат BioMed Central Ltd. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Central Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), которая разрешает неограниченное использование,
, а также воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания авторства на оригинальную работу. Отказ Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) распространяется на данные, представленные в этой статье, если не указано иное.
, но тогда доступ к корневой системе будет скомпрометирован. Кроме того, при планировании экспериментов на твердой среде следует также учитывать дополнительное обращение и, следовательно, ненужный стресс растений во время переноса проростков на новую питательную среду, а также во время сбора растительного материала.
Одна из стратегий обойти все проблемы, описанные выше, — это использование гидропонных систем для выращивания растений. Сообщалось о нескольких гидропонных системах для Arabidopsis [4-13], и некоторые из них в настоящее время коммерчески доступны (Aeroponics®) [12].Большинство этих систем объединены пластиковым, стеклянным или поликарбонатным контейнером с держателем семян, состоящим из минеральной ваты, полиуретановой (губчатой) детали, стальной или нейлоновой сетки, полиэтиленового гранулята или поливинилхлорида (ПВХ). Это открытые системы, которые допускают аксенические условия или снижают загрязнение водорослями жидких питательных сред, но стерильность невозможна.
Здесь мы шаг за шагом описываем протокол создания простой и недорогой гидропонной системы, которая обеспечивает условия стерильности для выращивания арабидопсиса и других модельных растений.Эта новая система идеально подходит для крупномасштабных манипуляций с рассадой и даже для полностью сформировавшихся растений. Наша система является улучшенной версией Schlesier et al. [8], в котором исходная стеклянная банка и стальной держатель семян заменены полупрозрачным полипропиленовым (PE) контейнером и куском сетки из полиэтилена высокой плотности (HDPE). Все компоненты можно автоклавировать, использовать повторно, они дешевы и легко доступны у местных поставщиков. Новое устройство, разработанное в качестве держателя семян, позволяет избежать использования легкоплавкой агарозы в качестве опоры для семян, что позволяет быстро и легко переносить их в новые условия среды и / или собирать растительный материал.Эффективность и функциональность предлагаемой нами системы продемонстрирована и проиллюстрирована в экспериментах, которые показали типичные ранние транскрипционные изменения при голодании по Pi и инфекции патогенами.
Результаты и обсуждение
Описание гидропонной системы
Мы усовершенствовали ранее описанную гидропонную систему, состоящую из стеклянного сосуда и детали из нержавеющей стали, объединенной проволочной сеткой, закрепленной между двумя плоскими кольцами и удерживаемой на месте тремя ножками [8], с помощью более простой и дешевой системы, собранной с полиэтиленовым сосудом. и держатель семян, объединенный сеткой из полиэтилена высокой плотности круглой формы и двумя кольцами из полиэтилена (рис. 1A, B; таблица 1).Используемые здесь сосуды и сетка легко доступны на местных рынках; сосуды на самом деле представляют собой контейнеры для пищевых продуктов (Microgourmet®, Solo Cup, США, www. solocup.com), доступные в магазинах пищевых упаковок, в то время как сетка из полиэтилена высокой плотности представляет собой кусок сетки от тли, приобретенный в местных магазинах, поставляющих тепличные принадлежности (www.textile sagricolas. mx). Небольшое отверстие в крышке контейнера, заполненное хлопковой пробкой, обеспечивает обмен газа в системе (рис. 1C). Этот вентиляционный фильтр снижает, но не устраняет высокий
Рис. 1 Гидропонная система: размеры и сборка компонентов.A и B) Размеры и сборка держателя семян. В) Собранная гидропонная система. Показаны емкости с разным объемом для жидких сред. Цифры в нижней части контейнера указывают максимальный объем, а число внутри контейнера — объем жидкой среды, используемой в каждом случае.
Влажностьв средней емкости. Эту проблему можно решить, добавив больше вентиляционных фильтров или используя другие герметизирующие материалы, например, бумажную ленту Micropore 3 M®. Для нашей гидропонной системы не требуется аэрация жидкой среды.При использовании небольших резервуаров в качестве средних контейнеров отрицательного воздействия на рост растений не наблюдалось (ссылки в таблице 1).
Новый держатель семян для размещения семян поверх жидкой среды состоит из сетки из моноволокон из полиэтилена высокой плотности, зажатой между двумя кольцами из полиэтилена (кольцо A и B), с площадью 78,54 см2 (диаметр = 10 см), которая может удерживайте от 50 до 65 сеянцев Arabidopsis в течение 10-15 дней после прорастания (Рисунок 1A, B; Рисунок 2) (Таблица 1). Полностью развитые растения арабидопсиса (2-3 растения на сосуд) также можно выращивать в этой системе, если крышку контейнера заменить другим контейнером из полиэтилена (дополнительный файл 1).Сетка против тли с размером отверстия 0,75 мм на 0,75 мм (размер ячейки обычно называется 25 x 25) достаточна для хранения семян Arabidopsis поверх сетки (Рисунок 2A, B) и обеспечения независимого развития корневой системы (Рисунок 2C, D, E). Сетка против тли или насекомых с более низкой плотностью может быть полезна для семян большего размера, чем семена арабидопсиса. В нашей гидропонной системе не требуются ножки для поддержки держателя сетки. Держатель семян просто помещается в контейнер
.д и н.
1 я — г
Таблица 1 Сравнение между ранее описанными гидропонными системами и предлагаемой здесь системой 2 года
Параметр Пластиковый держатель, наполненный агаром Пластиковый держатель, наполненный минеральной ватой Губка в листе полипропилена Гранулят полиэтилена Нержавеющая сетка, фиксированная двумя металлическими приспособлениями / нейлоновая сетка на держателе для слайдов Эта система
Контейнер для жидкой среды Пластиковый ящик Пластиковый ящик Пурпурный сосуд GA-7® Стеклянный сосуд Стеклянные сосуды с круглыми краями / стеклянный сосуд Пластиковый контейнер
Затраты От среднего до высокого Промежуточный высокий высокий высокий низкий
Время установки От среднего до высокого Промежуточное от низкого низкого высокого от низкого до среднего
Повторное использование держателя семян Нет Нет Нет Нет Да / Нет Да
Пропускная способность Средний Средний Высокий Высокий Высокий / средний Средний
Объем контейнера От малого до высокого От малого до среднего От малого до высокого Средний От среднего до высокого
Средняя испаряемость Высокая Высокая Низкая Высокая Низкая / Высокая Низкая
Число сеянцев на держатель Один Один Один Многие Многие Многие
Стерильность Нет Нет Да Нет Да / Нет Да
Аэрация Да / Нет Да / Нет Нет Нет Нет Нет
Время для перемещения и отбора проб больших партий растений между средами Высокая Высокая Высокая Высокая Высокая Низкая
Окно развития Взрослые растения Взрослые растения От рассады до взрослых растений Рассада Рассада от рассады до взрослых растений
Ссылки [3,9,12] [4,10,11] [6] [7] [5,8,13]
QJ IÛ
Рис. 2 Саженцы арабидопсиса, выращиваемые в предлагаемой гидропонной системе.А) Семена высеваются на семяпровод сетки. Показано крупное изображение одного семени (вставка). Б-Д) Саженцы, растущие в нашей гидропонной системе. 12-дневные сеянцы сверху (B) и сбоку (C). Трехнедельные сеянцы сверху (D) и сбоку (E).
и удерживается на месте путем прижатия к стенкам контейнера. В отличие от других протоколов, о которых сообщалось ранее (таблица 1), размер контейнера описываемой здесь системы может варьироваться в зависимости от требуемого объема среды (рисунок 1C). Однако тот же стандартный держатель семян можно использовать для контейнеров на 1000 мл, 750 мл или 500 мл, обеспечивая эффективный объем для роста корней 600 мл, 350 мл и 210 мл соответственно (рис. 1C).
Наша гидропонная система может использоваться для выращивания других модельных видов в асептических условиях. Семена Solanum lyco-persicum, Nicotiana tabacum и Setaria viridis стерилизовали и высевали непосредственно на сетку. У всех видов через две недели после прорастания наблюдался адекватный рост побегов и корневой системы (рис. 3).
Другие преимущества этой гидропонной системы связаны с переносом растений и сбором растительных тканей. В обоих случаях требуется только предварительно простерилизованный зажим для перевязочной ткани (6 или 12 дюймов), чтобы вытащить держатель семян и поместить его в новую среду (рис. 4A) или погрузить в контейнер с жидким азотом для сбора тканей. (Рисунок 4B).Сбор корней молодых проростков гидропонной системы также проще и требует меньше времени, чем сбор корней из проростков, выращенных в агаризованной среде. При извлечении держателя семян из контейнера молодые корни прилипают к сетке, их можно промокнуть впитывающим бумажным полотенцем и немедленно заморозить в жидком азоте. Биомассу побегов также можно легко отделить от сетки с помощью скальпеля, а затем сетку с прикрепленными корнями можно обработать отдельно.
Рис. 4 С помощью этой гидропонной системы можно легко и быстро перейти на новую питательную среду и / или собрать корень.А) Саженцы табака передаются только с держателем семян. Б) Партия саженцев табака, растущих на семяпроводе, замороженных в жидком азоте.
Протокол настройки гидропонной системы
Пошаговые инструкции по настройке гидропонной системы приведены в следующем разделе и в дополнительном файле 2. Также указаны советы и важные примечания.
1. Получение нейлоновой сетки (см. Рисунок 1A)
Приобретите кусок сетки от тли или насекомых.Нарисуйте круг (диаметром 10 см) маркером и картонным шаблоном. Обрежьте круг вилкой. Споткнув круг, удалите цветные следы на сетке, используя абсолютный спирт. Промойте сетку под проточной водой (вариант: используйте деионизированную воду). Высушите на бумажных полотенцах. Совет: используйте для рисования маркер красного цвета. Красный цвет чистить легче, чем другие цвета.
2. Изготовление держателя сетки (см. Рис. 1A, B)
Разрежьте дно полиэтиленового контейнера объемом 500 мл. Используйте лезвие скальпеля.Оставьте небольшой край (шириной 0,5 см). На этот край наденет сетчатый круг. Для кольца А оставьте высоту 2,5 см, для кольца Б оставьте 3 см. Совет: используйте лезвие скальпеля с прямым наконечником, чтобы легко разрезать дно контейнера.
3. Подготовка крышки контейнера
Найдите центр крышки контейнера и отметьте его. Просверлите центр крышки. Закройте небольшое отверстие в крышке ватным тампоном. Совет: горячим гвоздем растопите отверстие в крышке, чтобы не было заусенцев.
4.Стерилизация
Контейнер, кольца и сетку необходимо стерилизовать отдельно в автоклаве (121 ° C и давление 15 psi в течение 20 минут). Поместите контейнер, кольцо и сетку в полиэтиленовые пакеты. Для контейнеров и колец закройте полиэтиленовые пакеты, но не запечатывайте их. В таком случае колебания давления во время стерилизации могут повредить их. Важный момент: Поместите автоклав в жидкую среду
.режим. Совет: после стерилизации поместите полиэтиленовые пакеты в другой, чтобы снизить риск заражения.
5. Сборка гидропонной системы (см. Рисунок 1C)
Откройте стерилизованные полиэтиленовые пакеты с контейнерами, кольцами, сетками и крышками. Налейте в емкость объем предварительно простерилизованной жидкой среды. Совет: использование жидких сред при комнатной температуре снижает образование конденсата пара на крышке и стенках емкости. Возьмите кольцо B с помощью пинцета для перевязочной ткани и поместите его в емкость чуть выше уровня жидкой среды. Наденьте кусок сетки на кольцо B, медленно поднимите его, а затем верните на кольцо, избегая образования пузырей.Установите кольцо А на сетку. Совет: если кольцо А трудно надеть на сетку, быстро нагрейте кольцо с помощью горелки Бунзена. Наконец, закройте контейнер.
Применения нашей гидропонной системы: 1) Быстрые транскрипционные ответы на голодание по Pi
Применение этой новой гидропонной системы культивирования для модельных растений было проанализировано в этом исследовании. Изменения во время голодания по Pi на уровне транскрипции, связанные с модификациями RSA Arabidopsis, были описаны ранее [13].Здесь сначала мы сравнили влияние доступности Pi на RSA и профили экспрессии восьми маркерных генов дефицита Pi в проростках Arabidopsis, выращенных в гидропонике, по сравнению с агаровой средой. Затем, пользуясь преимуществом короткого времени, которое требуется с этой новой гидропонной системой для переноса растений в различные среды, ранние транскрипционные ответы на истощение Pi были исследованы на уровне всего генома; такие ответы ранее не оценивались.
Гены, чувствительные к росту и истощению Pi у Arabidopsis, на гидропонных средах с недостатком Pi
Семена Arabidopsis проращивали и выращивали в течение 12 дней в гидропонике или агаровой среде, содержащей высокое содержание Pi (1.M) концентрации, как сообщалось ранее [14,15]. К 12 дню после прорастания проростки арабидопсиса, выращенные на гидропонике, производили более высокую биомассу побегов и корней, чем сеянцы, выращенные на твердой среде (рис. 5A, B), что согласуется с предыдущими сравнениями между обоими методами выращивания Arabidopsis [5]. Типичное увеличение накопления биомассы корней при стрессе Pi наблюдалось у проростков, выращенных в агаризованной среде, однако такое изменение не было статистически значимым (Рисунок 5B). Напротив, сухой вес корней проростков, выращенных на гидропонике при стрессе Pi, составлял 2.В 25 раз выше, чем у проростков, достаточных для Pi (рис. 5B). Этот более высокий рост корней при низком Pi является типичным изменением RSA, которое позволяет увеличить поглощение Pi в естественных почвенных условиях [14]. Что касается адаптации RSA к низкой доступности Pi, мы также обнаружили уменьшение длины первичного корня на 30% по сравнению с контролем
.Рис. 5 Рост растений в гидропонных или твердых средах при контрастных режимах Pi (A-F). Проростки арабидопсиса высевали непосредственно на держателе семян (50-60 семян на ячейку) или агаровой среде (30-35 семян на чашку), выращивали в течение 12 дней при двух различных режимах Pi (-P = 10 [мкМ Pi, + P = 1.25 мМ Pi), а затем проанализировали. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартная ошибка (гидропоника, биологические повторы = 5, n = 20-60; агаровая среда, биологические повторы = 10-15, n = 15). Звездочки обозначают достоверное отличие от соответствующего контроля (обработка + P) согласно t-критерию Стьюдента (P <0,05).
Поглощениепитательных веществ и голодание по Pi облегчают резкие изменения RSA, обычно наблюдаемые в корнях проростков, выращенных в агаризованной среде.
После этого мы определили эффективность гидропонной системы для индукции экспрессии генов с низким уровнем Pi.Анализ профилей экспрессии восьми генов, участвующих в транскрипционной, метаболической и морфологической реакции на голодание по Pi, был проведен на целых проростках арабидопсиса, выращенных в гидропонных условиях с низким или высоким Pi при 4, 7, 12, 14, 17. и 21 день. Количественная оценка уровня транскрипции факторов транскрипции (TF) PHR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1), WRKY75 (семейство TF WRKY) и bHLh42 (TF, содержащего основной домен спираль-петля-спираль) выявила прямое влияние персистенции стресса Pi на рост регуляция этих трех молекулярных модуляторов [16-18].WRKY75 имел самый высокий уровень экспрессии среди проанализированных ТФ со значительной индукцией экспрессии через 12 дней в условиях дефицита Pi (фиг. 6A). BHLh42 показал аналогичное увеличение экспрессии. Поскольку большинство молекулярных ответов на голодание по Pi затронуты у мутанта phr1, PHR1 считается
в условиях гидропоники, в то время как такое снижение было выше (76%) в корнях из агаризованной среды (рис. 5C). Точно так же наблюдалось умеренное увеличение плотности боковых корней и корневых волосков при низком уровне Pi в жидких средах, тогда как заметное увеличение при тех же условиях роста Pi было обнаружено в агаризованных средах (рис. 5D, E, F).
Хотя влияние дефицита Pi на развитие корней было более серьезным в агаризованных средах, чем в нашей гидропонной системе, типичные модификации корней, вызванные стрессом Pi (первичное укорочение корня и более высокое образование боковых корней и корневых волосков) [14], наблюдались в обеих системах. Различия в величине изменений RSA в ответ на депривацию Pi можно объяснить вариациями в составе среды, вызванными добавлением гелеобразующих агентов, и / или легкостью доступа к Pi, доступному в используемых системах роста.Ранее было показано, что загрязнители, такие как Pi, железо и калий в гелеобразующих соединениях, могут изменять морфофизиологический и молекулярный ответ на голодание по Pi [1]. Гидропоника обеспечивает лучший контроль над составом среды и обеспечивает прямой и однородный контакт всей корневой системы с жидкой средой. Это состояние можно улучшить
Рисунок 6. Профили экспрессии маркерных генов для Pi голодания в проростках Arabidopsis, выращенных на гидропонике, с помощью qRT-PCR.
Профили экспрессии A) модуляторов транскрипции и генов, участвующих в росте меристемы корня, и B) передачи сигналов и рециклинга Pi. Проростки арабидопсиса выращивали в течение 21 дня при двух различных режимах Pi (-P = 10 мкМ Pi, + P = 1,25 мМ Pi). РНК целых проростков экстрагировали в шести временных точках, и уровни экспрессии генов анализировали с помощью анализов qRT-PCR. Относительное количественное число (RQ) получали из уравнения (1 + e) 2mct, где ДДСТ представляет ACT (-P) -ACT (+ P), а E — эффективность ПЦР.Значение CT было предварительно нормализовано с использованием уровней экспрессии ACT2, PPR и UBHECT в качестве внутренней ссылки. Представленные данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех биологических репликатов (n = 100-150).
главный контроллер сигнального пути Pi [16,19]. В случае PHR1 мы обнаружили, что этот ген не обнаруживает такой конститутивной экспрессии при дефиците Pi, как первоначально сообщалось [16]. Вместо этого профиль экспрессии этого главного регулятора в корнях показал чувствительность к условиям с низким уровнем Pi (фиг. 6A).Эти данные согласуются с низкой индукцией транскрипции PHR1, ранее наблюдаемой в побегах Arabidopsis [20]. LPR1 (НИЗКИЙ ФОСФАТ 1) и PDR2 (ОТВЕТ НА ДЕФИЦИТ ФОСФАТА 2), два гена, участвующие в росте корневой меристемы [21], и конъюгата убиквитина E2 PHOSPHATE 2 (PHO2 / UBC24), связанная с загрузкой Pi [22], показали заметную увеличение экспрессии через 14 дней лечения (рис. 6А). Напротив, SPX1 (ген, кодирующий белок с доменом SYG1 / Pho81 / XPHR1) и PLDZ2 (PHOSPHOLIPASE DZ2), два типичных маркерных гена дефицита Pi, участвующих в передаче сигналов и рециклинге Pi [23,24] соответственно, показали значительную индукцию. начиная с четвертого дня.И SPX1, и PLDZ2, но особенно SPX1, имели заметное увеличение уровня экспрессии (Рисунок 6B). Анализ экспрессии этих Pi-чувствительных генов вместе с анализом RSA во время голодания по Pi на гидропонике демонстрирует высокую производительность нашей системы для выращивания растений и для анализа молекулярных ответов на дефицит питательных веществ.
Изучение ранних транскрипционных ответов в масштабе всего генома на истощение Pi: обзор и функциональная классификация дифференциально экспрессируемых генов
Ранние транскрипционные ответы на доступность Pi на уровне всего генома (от 4 часов до <12 часов) были ранее определены у целых проростков Arabidopsis с использованием платформ микромассивов [25,26].Важным экспериментальным условием в этих исследованиях было использование 100-200 мкМ в качестве низкой концентрации Pi, считающейся достаточной для поддержания накопления биомассы, но не для индукции чрезмерного накопления Pi [26]. Сообщалось, что проростки арабидопсиса, растущие при 100 мкМ Pi в агаризованной среде, имели такие же эндогенный фосфор (P), продукцию биомассы и RSA, что и проростки, растущие при 1 мМ Pi [14]. В жидких средах 200 мкМ Pi также рассматривается как Pi-достаточное условие для выращивания однодольных растений, таких как кукуруза [27].Мы обнаружили, что проростки арабидопсиса, выращенные с 250 мкМ Pi в жидких средах, не способны индуцировать экспрессию AtPT2 / AtPHT1; 4 (PHOSPHATE TRANSPORTER 2), высокоаффинного переносчика Pi, реагирующего на голодание по Pi, описанного в [28], как показал анализ. проростков Arabidopsis, несущих транскрипционный репортер AtPT2 :: GUS. Сеянцы, растущие в гидропонике в течение 12 дней, показали нулевую экспрессию репортера ни в побеге, ни в корне. Когда эти проростки были перенесены в среду с истощенной Pi, репортер AtPT2 :: GUS был обнаружен через 12 часов после переноса (рис. 7).
Чтобы продемонстрировать эффективность нашей системы для выявления ранних транскрипционных ответов, Arabidopsis
проростков прорастали и выращивали в системе гидропоники с 125 мкМ Pi в течение 12 дней, а затем сразу лишали Pi. Образцы были взяты в трех кратковременных точках (10 мин, 30 мин и 2 ч) (рис. 8А). Корни собирали и замораживали сразу после каждой временной точки, извлекали общую РНК и анализировали их транскриптом с помощью профилирования экспрессии микроматрицы.Для анализа данных были выявлены различия в экспрессии генов между истощенными по Pi и достаточными по Pi корнями (общий эффект доступности P), а также различия, вызванные доступностью Pi во временном взаимодействии (эффект времени x Pi). В соответствии с используемыми уровнями строгости (FDR <0,05 и кратность ± 2) в общей сложности 181 ген показал дифференциальную экспрессию по крайней мере в одной из трех выбранных временных точек (см. Дополнительный файл 3). Было обнаружено, что в общей сложности 92 гена активируются и 89 подавляются за счет истощения Pi (рис. 8B).Интересно, что только 3 гена из 92 индуцированных и 1 подавленный из 89 репрессированных были общими для всех трех оцениваемых временных точек, что указывает на специфические транскрипционные ответы в зависимости от анализируемой временной точки (рис. 8B). При объединении в функциональные классификации (таблица 2 и дополнительный файл 3) некоторые из них напоминали те, о которых сообщалось ранее [25-27,29], тем самым подтверждая нашу систему для высокопроизводительного транскрипционного анализа. Согласно профилю экспрессии гены с повышенной регуляцией были сгруппированы в шесть различных групп, тогда как только три группы были идентифицированы для репрессированных генов (дополнительный файл 3).Анализ паттернов экспрессии с помощью агломеративной иерархической кластеризации показал большое количество активируемых генов в последний оцениваемый момент времени (2 часа), в то время как противоположная тенденция наблюдалась для генов с пониженной регуляцией, которые были более чувствительны в первый момент времени (10 минут). ) (Рисунок 8C). Дифференциально экспрессируемые гены были классифицированы по функциональным категориям в соответствии с классификацией Мюнхенского информационного центра белковых последовательностей (MIPS) с использованием базы данных FunCat [30]. Категории, более представленные в активированных генах, были связаны с метаболизмом, транскрипцией, метаболизмом белков и взаимодействием с окружающей средой (таблица 2).Кроме того, было аналогичное количество индуцированных и репрессированных генов в категориях метаболизма Pi, фосфолипидов и фосфолипидов, за исключением тех, которые связаны с метаболизмом гликолипидов. Интересно, что категория «Энергия» (гликолиз, глюконеогенез, пентозофосфатный путь, дыхание, преобразование и регенерация энергии и поглощение света) была представлена только в индуцированных генах (Таблица 2).
Ранние транскрипционные ответы на низкую доступность Pi включают модификации клеточной стенки, активность белка, окислительно-восстановительные процессы и опосредованную гормонами передачу сигналов, которые предшествуют описанным сигнальным путям Pi
Согласно функциональной аннотации базы данных информационных ресурсов Arabidopsis (TAIR, www.арабидопсис. org), большинство генов либо индуцированы, либо репрессированы в течение
Истощение числа пи
Mock 48 ч 1 ч 4 ч G ч 12 ч 24 ч 48 ч
, если (P
I # H i
Рисунок 7 Паттерн экспрессии AtPT2 :: GUS при истощении Pi. Проростки Arabidopsis AtPT2 :: GUS выращивали на гидропонике в течение 12 дней при достаточном уровне Pi (125 мкМ Pi), а затем переносили в жидкую среду, обедненную Pi, или контрольную среду (125 мкМ Pi, имитация).Активность GUS в листьях и корнях контролировали с помощью гистохимического анализа в разные моменты времени. Выражение GUS в ложном состоянии показано в последний раз (48 ч).
Рис. 8 Ранние изменения транскриптома корней Arabidopsis при голодании по Pi. А) Рабочий процесс для экспериментов. Проростки арабидопсиса выращивали на гидропонике в течение 12 дней при достаточном уровне Pi (125 (M Pi), а затем на короткое время переносили в жидкую среду, обедненную по Pi. Корни собирали, выделяли РНК и анализировали транскриптом с использованием платформы олигонуклеотидных микрочипов.Б) Диаграммы Эдвардса-Венна, показывающие общие или отдельные регулируемые гены в выбранных временных точках. C) Кластеризация дифференциально экспрессируемых генов. Кластеризацию проводили с использованием гладкой корреляции и кластеризации среднего сцепления в программном обеспечении GeneSpring GX 7.3.1 (Agilent Technologies). Оранжевый указывает на повышенную регулировку, зеленый — на пониженную, а белый — на неизменные значения, как показано на цветовой шкале в правой части рисунка.
Таблица 2 Распределение функциональных категорий дифференциально экспрессируемых генов, отвечающих на депривацию Pi в короткие временные точки в корнях Arabidopsis
Функциональная категория * Гены с повышенной / понижающей регуляцией ** (%)
Выборка временной точки
10 мин 30 мин 2 ч
Метаболизм 9.67 / 15,9 21,4 / 7,14 34,1 / 24,1
Энергия 3,22 / — 10,7 / — 2,43 / —
Клеточный цикл и обработка ДНК 3,22 / 2,27 3,57 / 7,14 4,87 / 6,89
Транскрипция 12,9 / 4,54 7,14 / 21,4 12,1 / 10,3
Судьба белка 3,22 / 13,54 7,14 / 7,14 12,1 / 13,7
Белок с функцией связывания или потребность в кофакторе 16,1 / 15,9 32,1 / 7,14 21,9 / 27,5
Регуляция обмена веществ и функции белков — 3.57 / 7,14 2,43 / 3,44
Транспортировка клеток, транспортные средства и транспортные маршруты 9,67 / 4,54 14,2 / 7,14 7,31 / 10,3
Сотовая связь / механизм передачи сигнала — / 2,27 — / 14,2 — / 3,44
Спасение, защита и вирулентность клеток 3,22 / 2,27 10,7 / 14,2 9,75 / 10,3
Взаимодействие с окружающей средой 9,67 / 2,27 21,4 / 21,4 2,43 / 6,89
Систематическое взаимодействие с окружающей средой 3.22 / 2.Функциональные категории согласно классификации Мюнхенского информационного центра белковых последовательностей. 5 минимум ± 2 в любой момент времени и FDR <0,05. ** Дифференциально экспрессируемые гены с кратным изменением при
.первых 30 минут истощения Pi связаны с составом клеточной стенки, активностью белка, окислительно-восстановительной и опосредованной гормонами передачей сигналов. Ранее известные Pi-чувствительные гены, такие как MGDG SYNTHASE 3 (MGD3), SQDG SYNTHASE 2 (SQD2), ФОСФАТАЗА 22 ФИОЛЕТОВОЙ КИСЛОТЫ (PAP22) и S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHASE 1 (SAM1), показали значительные изменения в экспрессии до последней оцененной временной точки ( 2 ч).Интересно, что несколько регуляторов транскрипции экспрессировались по-разному на протяжении всего эксперимента.
Через 10 минут корни арабидопсиса ответили на депривацию Pi активацией 27 генов (18,5% от общего числа), участвующих в деградации полисахаридов, отложении каллозы, биосинтезе пектина, размножении клеток и организации цитоскелета микротрубочек (см. Группу I, Дополнительные файл 3). Также были представлены наборы генов, связанные с окислительно-восстановительными процессами, модификациями активности белков (убиквитинирование, миристоилирование, АТФ или связывание ионов) и опосредованной гормонами передачи сигналов (абсцизиновая кислота, жасмоновая кислота).Избыточное представительство групп в соответствии с функциональными процессами не было ясным в генах с пониженной регуляцией, за исключением генов, связанных с модификациями судьбы белков (13,5% от общего числа 44 генов).
По мере того, как истощение Pi прогрессировало (30 мин), транскрипционные изменения, связанные с клеточной стенкой, уменьшались, в то время как ответы на перенос ионов, передачу сигналов гормонами (ауксинами, абсцизовой кислотой, салициловой кислотой) или киназами были более представлены в
индуцированных и репрессированных генов (дополнительный файл 3).В генах с пониженной регуляцией эта тенденция также была обнаружена в последний момент времени (2 ч). Интересно, что через 30 минут гены, участвующие в Pi-гомеостазе, например SPX1 и ГЛИЦЕРОЛ-3-ФОСФАТНЫЙ ПЕРМИЗ 1 (G3Pp1) уже были индуцированы (см. Группы IV и V, дополнительный файл 3).
Более высокое количество активируемых генов было обнаружено через два часа после истощения Pi. Большинство индуцированных генов (9 из 37 генов) были связаны с переносом ионов или гомеостазом, но также были связаны с метаболизмом углеводов, окислением-восстановлением, передачей сигналов, активностью и развитием белков.Важно отметить, что другие типичные молекулярные маркеры голодания по Pi также индуцировались в течение 2 часов. Две фосфатидатфосфатазы (PAP) (At3g52820 и At5g44020) индуцировались постепенно по мере протекания Pi-голодания. MGD3 и SQD2, оба участвующие в рециркуляции Pi, также индуцировались через 2 часа (см. Группу VI, дополнительный файл 3). Экспрессия этих генов вместе с SPX1 и G3Pp1 указывает на то, что классические пути трансдукции, связанные с Pi-голоданием, могут запускаться уже через два часа после воздействия на проростки среды, в которой отсутствует Pi.SPX1 сильно индуцируется голоданием по Pi и обычно классифицируется как член системного сигнального пути в зависимости от SIZ1 / PHR1, рассмотренного в [31]. Ранее сообщалось о его ранней индукции (3-12 ч) [25], однако о «немедленном-раннем ответе» в течение нескольких минут после истощения Pi пока не сообщалось. Аналогично,
Рольв усиленной экспрессии G3Pp1 внутри путей трансдукции или метаболических перестройках, запускаемых стрессом Pi, все еще плохо изучена [25,26].Недавняя функциональная характеристика семейства глицерофосфодиэфирфосфодиэстеразы Arabidopsis (GDPD) предполагает, что глицерин-3-фосфат (G3P) является источником Pi или фосфатидной кислоты (PA), которые могут использоваться глицерин-3-фосфатазой (GPP) или DGDG / SQDG. пути [32]. Ранняя индуцированная экспрессия G3Pp1, PAP22 и MGD3 согласуется с гипотезой о том, что при дефиците Pi G3P может сначала превратиться в PA посредством двух реакций ацилтрансферазы, а Pi будет затем высвобождаться во время последующего превращения PA в диацилглицерин (DAG). от PAPs [32].Полученный DAG мог быть включен в DGDG или SQDG посредством MGD2 / 3 и DGD1 / 2 и SQD1 / 2, соответственно [32]. Было обнаружено, что MGD2 и MGD3 индуцируются у проростков Arabidopsis, истощенных по Pi в течение 3-12 часов [25]. Эта ранняя транскрипционная активность генов MGD во время голодания по Pi также отражается в повышенной ферментативной активности, что обнаружено в корнях фасоли, лишенных Pi [33]. Сообщалось о повышенных уровнях PA и активности MGDG и DGDG в корнях бобов, лишенных Pi менее чем на 4 часа [31]. Активация ранней генной экспрессии генов, кодирующих MGDG и DGDG, но не ферментов PLD / C, предполагает, что G3P, а не PC, являются источником биосинтеза PA и DAG для ранних путей передачи сигналов и рециклинга Pi.
Согласно нашим данным, конкретному пути трансдукции к дефициту Pi могут предшествовать общие реакции, связанные со стрессом, которые могут изменять метаболизм до запуска специфической экспрессии транскрипционных факторов. Эта идея согласуется с предыдущими отчетами об анализе истощения Pi у Arabidopsis за короткий и средний-долгий периоды времени (3-48 часов), в которых также сообщалось о дифференциально экспрессируемых генах, связанных с патогенезом, гормонально-опосредованной передачей сигналов, белковой активностью, окислительно-восстановительными процессами, переносом ионов. , и модификации клеточной стенки [25,28,34].Аналогичные результаты были недавно получены на проростках риса при 1-часовом голодании по Pi [35].
Применение нашей гидропонной системы: 2) Патологические тесты для оценки системных защитных реакций
Чтобы определить пригодность нашей гидропонной системы для взаимодействия арабидопсиса с патогеном, мы оценили системный эффект инокуляции корней штаммом DC3000 томатов Pseudomonas syringae pv pv (Pst DC3000) на транскрипционную активацию гена PR1, связанного с патогенезом.Хотя P. syringae обычно известен как листовой патоген, было доказано, что он является отличным колонизатором корней арабидопсиса [36,37]. Проростки трансгенного Arabidopsis, несущие конструкцию PR1 :: GUS, выращивали в течение 12 дней, а затем инокулировали 0,002 OD600 свежего бактериального инокулята. | Активность 3-глюкуронидазы (GUS) анализировали гистохимическим окрашиванием через различные интервалы времени после инокуляции. Системный ответ на колонизацию корней Pst был очевиден между 2 и 6 часами после инокуляции (hai), о чем свидетельствует сильная экспрессия маркерного гена в листьях.После 24 га активность GUS распространилась по всей системе побегов, но не в корнях (рис. 9). Эти результаты демонстрируют хорошие результаты при изучении реакции растений на патогены.
Выводы
Здесь мы описываем практичную и недорогую гидропонную систему для выращивания Arabidopsis и других растений в стерильных условиях с окном роста in vitro, которое идет от всходов до взрослых растений. В нашей системе используются перерабатываемые и пластиковые материалы, которые можно стерилизовать с помощью обычного автоклавирования, которые легко найти на местных рынках.В отличие от других гидропонных систем, о которых сообщалось ранее, компоненты системы (размер контейнера, плотность ячеек, крышка), описанные здесь, могут быть легко адаптированы к различным экспериментальным проектам или видам растений. Держатель семян избегает использования пробки из агарозы или любых других принадлежностей, сокращая время на постановку экспериментов и уменьшая риски заражения.
Примеры применения и преимущества нашей гидропонной системы представлены в этом отчете. Во-первых, быстрые изменения транскриптома корней Arabidopsis, вызванные истощением Pi
.Инкубация с R syringae pv.помидор
Mock 24 ч 15 мин 30 мин 1 ч 2 ч 6 ч 24 ч
Лист а к,
м м ¡¡u © HI
Рисунок 9 Паттерн экспрессии PR1 :: GUS под P. syringae pv. инкубация томатов. Проростки Arabidopsis PR1 :: GUS выращивали на гидропонике, а затем переносили в жидкую среду, содержащую бактерии P. syringae (конечная OD 0,002 OD60o) или контрольную среду (имитация).Активность GUS в побегах и корнях контролировалась гистохимическим анализом в разные моменты времени. Выражение GUS в ложном состоянии показано для последней выбранной временной точки (24 часа).
были обнаружены благодаря быстрому сбору урожая из питательной среды с использованием нашей новой конструкции держателя семян. Наши анализы подтверждают, что ранние реакции корней арабидопсиса на истощение Pi включают активацию сигнальных путей, связанных с общим стрессом, прежде чем они запускают специфические для стресса Pi, и подтверждают идею о том, что G3P может быть источником Pi и других молекул в качестве PA во время ранней передачи сигналов. события, вызванные голоданием Пи.Во-вторых, наша гидропонная система показала высокую производительность при настройке тестов на патогенез.
Методы
Среда для выращивания
Для твердых или жидких сред использовали среду 0,1 X Murashige and Skoog (MS), pH 5,7, с добавлением 0,5% сахарозы (Sigma-Aldrich) и 3,5 мМ MES (Sigma-Aldrich). Для твердых питательных сред использовали агар для микроклонального размножения ТС растений (состав / чистота не предоставлены) (A296, Phyto-technology Laboratories, США) из видов гелидиум в концентрации 1% (мас. / Об.).
Растительный материал и условия роста
Arabidopsis thaliana экотип Columbia (Col-0, запас ABRC № 6000 из института SALK), маркерные линии PR1 :: GUS (At2g14610) (любезно предоставлены FM Ausubel) и AtPT2 :: GUS (At2g38940) [38], табак cv В этом исследовании использовались семена Xhanti, сорта томата Micro-Tom и Setaria viridis. Во всех случаях поверхность семян стерилизовали последовательной обработкой абсолютным этанолом в течение 7 минут, 20% (об. / Об.) Коммерческим отбеливателем в течение 7 минут и трижды промывали стерильной дистиллированной водой.После предварительной стерилизации семена сетарии помещали на ночь при -80 ° C, как рекомендовано [39]. Стерилизованные семена арабидопсиса яровировали при 4 ° C в течение 2 дней (твердая среда) или 4 дней (гидропоника). Для Arabidop-sis 50-65 семян высевали непосредственно на сетку держателя семян и 30-35 семян в чашки Петри (объем 50 мл, 15 мм x 150 мм, Phoenix Biomedical). Сеянцы всех оцениваемых видов выращивали при 22 ° C, за исключением табака, который выращивали при 28 ° C, в камерах для выращивания (Percival, Perry, IA, USA) с флуоресцентным светом (100 мкмоль м-2 с-1) и фотопериод 16 ч света / 8 ч темноты.
Анализ особенностей корневой архитектуры
Для определения особенностей архитектуры корня проростки выращивали на пластинах с агаром под углом 65 ° или в гидропонных условиях. Длина корня измерялась от кончика корня до основания гипокотилей. Для количественной оценки боковых корней (LR) все четко видимые вторичные корни учитывались при определении количества LR. Плотность корневых волосков рассчитывалась по изображениям корней, сделанным цифровой камерой, подключенной к стереомикроскопу AFX-II-A (Nixon, Tokyo).Статистический анализ количественных данных проводился с использованием статистических инструментов (t-критерий Стьюдента) программного обеспечения Microsoft Excel.
Анализ GUS
Для гистохимического анализа активности GUS проростки арабидопсиса инкубировали в течение 4 ч при 37 ° C в реакционном буфере GUS (0,5 мг / мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-bD-глюкуронида в 100 мМ натрия фосфатный буфер, pH 7). Расчистку проростков проводили по ранее описанной методике [40]. По крайней мере 15 трансгенных растений были проанализированы и визуализированы с использованием оптики Нормарского на микроскопе Leica DMR.
Анализ микрочипов
Корни собирали и немедленно замораживали, выделяли РНК с помощью реагента Trizol (Invitrogen) и очищали с помощью набора RNeasy (Qiagen), следуя инструкциям производителя. Слайды с микрочипами Spotten (Arabidopsis Oligonucleotide Array версия 3.0) были получены из Университета Аризоны (http: //.ag.arizona.edu/ microarray /). Три биологических реплики (150 проростков на реплику) использовали для выделения РНК и две технические реплики (в замене) для двухканальных микрочипов.Флуоресцентное мечение зондов, гибридизацию слайдов, отмывку и обработку изображений выполняли, как описано [27]. Конструкция петли использовалась, чтобы сопоставить различия в экспрессии генов между обработками и временными точками. Нормализация микромассивов и анализ данных для идентификации дифференциально экспрессируемых генов с как минимум двукратным изменением экспрессии проводились, как сообщалось ранее [27].
Данные микроматрицы депонированы в Gene Expression Omnibus (GEO) и доступны через серию GEO, номер доступа: GSE53114 (http: // www.г общей РНК с обратной транскриптазой SuperScript III (Invitrogen) и использовали для qRT-PCR (система ПЦР в реальном времени 7500, Applied Biosystems). Экспрессию маркерных генов для Pi-голодания анализировали с использованием олигонуклеотидов, перечисленных в дополнительном файле 4. Анализы экспрессии генов выполняли, как сообщалось ранее [27]. Вкратце, относительное количественное число (RQ) получали из уравнения (1 + E) 2AACT, где AACT представляет ACT (обработка) -ACT (контроль), а E — эффективность ПЦР. Каждый CT был предварительно нормализован с использованием уровней экспрессии ACT2 (At3g18780), PPR (At5g55840) и UPL7 (At3g53090) в качестве внутренних эталонов.г мл-1 рифампицина. Проростки PR1 :: GUS выращивали на гидропонике, как описано выше. Для заражения 12-дневных сеянцев
Бактериальную культурувыращивали в течение ночи в КБ при 28 ° C. Бактерии центрифугировали, трижды промывали стерильной водой и ресуспендировали в воде до конечного OD600 0,04. Соответствующий объем добавляли к среде для проростков до конечного значения OD6Qo 0,002. После заражения растительный материал собирали в нескольких временных точках для гистохимических анализов GUS и анализировали под микроскопом Leica DMR.
Дополнительные файлы
Дополнительный файл 1: Предлагаемые 35-40-дневные растения Arabidopsis, растущие в рамках нашей гидропонной системы. Семена Arabidopsis высевали непосредственно на держатель семян и по три взрослых растения на каждый сосуд, выращивающий до начала цветения.
Дополнительный файл 2: Видео, показывающее процесс сборки нашей гидропонной системы.
Дополнительный файл 3: гены, дифференциально экспрессируемые за счет истощения Pi в короткие моменты времени в корнях Arabidopsis.Дополнительный файл 4: праймеры для qRT-PCR, использованные в этом исследовании.
Сокращения
MGDG: моногалактозилдиацилглицерин; ДГДГ: дигалактозилдиацилглицерин; SQDG: сульфохиновозилдиацилглицерин.
Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Вклад авторов
FAC, CCV и LHE разработали новую гидропонную систему и разработали эксперименты.FAC, CCV, EIL, LYV, C-APT, AOA, AMB, S-IGM, DAG и B-APO проводили эксперименты. FAC, CCV, EIL и LHE проанализировали данные. FAC, CCV и LHE подготовили рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
Благодарности
Эта работа была частично профинансирована Медицинским институтом Говарда (грант 55003677) для LHE. FAC в долгу перед КОНАСИТ за получение докторской степени (1
). Авторы выражают благодарность Р. Саверсу (Лангебио) за предоставление S.viridens, JH Valenzuela для штамма томатов P. syringae pv, J. Antonio Cisneros-Durán (Cinvestav Unidad Irapuato) за его большую помощь с фотографиями и видео в этой работе, а также Flor Zamudio-Hernández и María de J. Ortega-Estrada за услуги микрочипов и qRT-PCR. Мы благодарны анонимным рецензентам за их положительные комментарии и тщательную ревизию для улучшения качества этой рукописи.
Сведения об авторе
1Laboratorio Nacionalde Genómica para la Biodiversidad (Langebio) / Unidad de Genómica Avanzada (UGA), Centro de Investigación y Estudios Avanzados del IPN, 36500 Ирапуато, Гуанахуато, Мексика.2Текущий адрес: Департамент биологических и экологических наук Института биотехнологии Хельсинкского университета, 00014 Хельсинки, Финляндия. 3 Текущий адрес: Instituto Politécnico Nacional, Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo IntegralRegionalUnidad Sinaloa, 81101 Guasave, Sinaloa, México. 4 Текущий адрес: Red de Estudios Moleculares Avanzados, Instituto de Ecología A.C. Carretera Antigua a Coatepec # 351, Xalapa
, Veracruz, México. 5 Текущий адрес: Instituto Tecnológico de Tepic, Laboratorio de Investigación Integralen Alimentos, División de Estudios de Posgrado, 63175 Tepic, Nayarit, México.Получено: 15 декабря 2013 г. Принято: 13 марта 2014 г. Опубликовано: 21 марта 2014 г.
Список литературы
1. Джайн А., Полинг, доктор медицины, Смит А.П., Нагараджан В.К., Ланер Б., Мигер Р.Б.,
Raghothama KG: Изменения в составе желирующих агентов влияют на
морфофизиологических и молекулярных ответов на дефицит фосфатов и других питательных веществ. Физиология растений 2009, 150: 1033-1049.
2.Gruber BD, Giehl RFH, Friedel S, von Wirén N: Пластичность корневой системы Arabidopsis в условиях дефицита питательных веществ. Физиология растений 2013, 1б3: 161–179.
3. Конн С.Дж., Хокинг Б., Дайод М., Сюй Б., Атман А., Хендерсон С., Окетт Л., Конн В., Ширер М.К., Фуэнтес С., Тайерман С.Д., Гиллихэм М.: Протокол: оптимизация гидропонных систем роста для анализа питания и физиологического анализа. Arabidopsis thaliana и других растений. Методы растений 2013, 9: 4. DOI: 10.1186 / 1746-4811-9-4.
4.Гибо Д.М., Хьюлетт Дж., Крамер Г.Р., Зееманн Дж. Р.: Максимальная биомасса Arabidopsis thaliana с использованием простого гидропонного метода с низкими эксплуатационными расходами и благоприятных условий окружающей среды. Физиология растений 1997, 115: 317-319.
5. Тода Т., Кояма Х., Хара Т.: Простой метод гидропонного культивирования для развития очень жизнеспособной корневой системы у Arabidopsis thaliana. Biosci Biotechnol Biochem 1999, стр. 3: 210–212.
6. Arteca RN, Arteca JM: Новый метод гидропонного выращивания растений Arabidopsis thaliana.Physiol Plant 2000, 108: 188-193.
7. Баттке Ф., Шрамель П., Эрнст Д.: Новый метод культивирования растений in vitro: выращивание ячменя в плавающей гидропонной системе. Завод Мол Биол Реп 2003, 21: 405-409.
8. Schlesier B, Bréton F, Mock H-P: система гидропонного культивирования для выращивания проростков Arabidopsis thaliana в стерильных условиях. Plant Mol Biol Rep 2003, 21: 449-456.
9. Норен Х., Свенссон П., Андерссон Б.: Удобная и универсальная гидропонная система выращивания Arabidopsis thaliana.Physiol Plant 2004, 121: 343-348.
10. Робисон М.М., Смид М.П., Волин Д.Д.: Высококачественные и однородные растения Arabidopsis thaliana, полученные простым и недорогим методом гидропонного выращивания. Может Дж. Бот 2006, 84: 1009-1012.
11. Хаттнер Д., Бар-Цви Д.: Улучшенный, простой гидропонный метод выращивания Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol Rep 2003, 21: 59-63.
12. Токен П., Корбесье Л., Авеланж А., Пильтен А., Куртем Э, Бернье Дж., Перильо С. Новая высокоэффективная гидропонная система с низкими эксплуатационными расходами для синхронного роста и цветения Arabidopsis thaliana.
БМК Завод Биол 2003, 3: 2.
13. Баргманн Б.Р., Бирнбаум К.Д.: Сортировка активированных флуоресценцией клеток протопластов растений. J Vis Exp 2010, 3б. http://www.jove.com/details.php7idH673, DOI: 10.3791 / 1673.
14. Лопес-Бусио Дж., Эрнандес-Абреу Э., Санчес-Кальдерон Л., Ньето-Хакобо М.Ф., Симпсон Дж., Эррера-Эстрелла Л.: Доступность фосфатов изменяет архитектуру и вызывает изменения в чувствительности к гормонам в корневой системе арабидопсиса.Физиология растений 2002, 129: 244–256.
15. Pérez-Torres CA, López-Bucio J, Cruz-Ramírez A, Ibarra-Laclette E, Dharmasiri S, Stelle M, Herrera-Estrella L. рецептор ауксина TIR1. Растительная клетка 2008,12: 3258-3272.
16. Рубио В., Линьярес Ф, Солано Р., Мартин А.С., Иглесиас Дж., Лейва А., Пас-Арес Дж .:
Консервативный фактор транскрипции MYB, участвующий в передаче сигналов фосфатного голодания как у сосудистых растений, так и у одноклеточных водорослей.Джин Дев 2001, 5: 2122-2133.
17. Девайя Б.Н., Картикеян А.С., Рагхотама К.Г.: Фактор транскрипции WRKY75 является модулятором накопления фосфата и развития корней у Arabidopsis. Физиология растений 2007, 143: 1789-17801.
18. Чен Ж., Ниммо Г. А., Дженкинс Г. И., Ниммо Х. Г.: BHLh42 модулирует несколько биохимических и морфологических процессов, которые отвечают на голодание по Pi у Arabidopsis. Biochem J 2007, 405: 191-198.
19. Бустос Р., Кастрилло Дж., Линьярес Ф., Пуга М.И., Рубио В., Перес-Перес Дж., Солано Р., Лейва А., Пас-Арес Дж.: Центральная регуляторная система в значительной степени контролирует транскрипционную активацию и репрессивные реакции на фосфатное голодание. у арабидопсиса.100H02.
20. Нильссон Л., Мюллер Р., Нильсен Т.Х. Повышенная экспрессия связанного с MYB фактора транскрипции, PHR1, приводит к усиленному поглощению фосфата в Arabidopsis thaliana. Растительная клеточная среда 2007, 30: 1499-1512.
21. Ticconi CA, Lucero RD, Sakhonwasee S, Adamson AW, Creff A, Nussaume L, Desnos T, Abel S: ER-резидентные белки PDR2 и LPR1 опосредуют реакцию развития корневых меристем на доступность фосфата. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 10б: 14174–14179.
22. Aung K, Lin SI, Wu CC, Huang YT, Su CL, Chiou TJ: pho2, сверхаккумулятор фосфата, вызывается бессмысленной мутацией в гене-мишени микроРНК399. Физиология растений 2006, 141: 1000-1011.
23. Дуань К., Йи К., Данг Л., Хуанг Х., Ву В., Ву П: характеристика подсемейства генов арабидопсиса с доменом SPX выявляет их
различных функций в устойчивости растений к фосфорному голоданию. Завод J 2008, 54: 965-975.
24.Крус-Рамирес А., Оропеза-Абурто А., Разо-Эрнандес Ф., Рамирес-Чавес Е., Эррера-Эстрелла L: фосфолипаза DZ2 играет важную роль в экстрапластидном биосинтезе галактолипидов и рециркуляции фосфатов в корнях арабидопсиса. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103: 6765-6770.
25. Миссон Дж., Рагхотама К.Г., Джайн А., Джухет Дж., Блок М.А., Блиньи Р., Ортет П., Крефф А., Сомервиль С., Роллан Н., Думас П., Накри П., Эррера-Эстрелла Л., Нуссом Л., Тибо М.С.: Полногеномный анализ транскрипции с использованием генных чипов Arabidopsis thaliana Affymetrix позволил определить реакцию растений на лишение фосфата.Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 11934-11939.
26. Моркуенде Р., Бари Р., Гибон И., Чжэн В., Пант Б. Д., Бласинг О., Усадель Б., Чеховски Т., Удварди М. К., Ститт М., Шайбл В. Р.: Полногеномное перепрограммирование метаболизма и регуляторных сетей арабидопсиса в ответ на фосфор. Среда растительной клетки 2007, 30: 85-112.
27. Кальдерон-Васкес С., Ибарра-Лаклетт Э., Кабальеро-Перес Дж., Эррера-Эстрелла Л.: Профилирование транскриптов корней Zea mays выявляет генные реакции на дефицит фосфата на уровне растений и видов.J Exp Bot 2008, 59: 2479-2497.
28. Нуссом Л., Канно С., Джавот Х., Марин Э., Почон Н., Аяди А., Наканиши TM, Тибо М.-С: Импорт фосфатов в растениях: акцент на переносчиках PHT1. Front Plant Sci 2011,2: 83.
29. Chacón-López A, Ibarra-Laclette E, Sánchez-Calderón L, Gutiérrez-Alanis D, Herrera-Estrella L: Глобальное сравнение паттернов экспрессии между нечувствительным к фосфору 4 и WT Arabidopsis показывает важную роль активных форм кислорода и жасмона. кислота в ответ кончика корня.Сигнальное поведение растений 2011, 6 (3): 382-392.
30. Ruepp A, Zollner A, Maier D, Albermann K, Hani J, Mokrejs M, Tetko I, Güldener U, Mannhaupt G, Münsterkötter M, Mewes HW: FunCat, функциональная схема аннотации для систематической классификации белков в целом геномы. Nucleic Acids Res 2004, 32: 5539-5545.
31. Нильссон Л., Мюллер Р., Нильсен Т.Х .: Рассечение транскриптома растений и регуляторных реакций на фосфатную депривацию. Physiol Plant 2010, 139: 129-143.
32. Cheng Y, Zhou W, El Sheery NI, Peters C, Li M, Wang X, Huang J: Характеристика семейства глицерофосфодиэфирфосфодиэстеразы Arabidopsis (GDPD) показывает роль локализованного в пластиде AtGDPDI в поддержании гомеостаза клеточного фосфата в условиях фосфатное голодание. Завод J 2011, 66: 781-795.
33. Руссо М.А., Квартаччи М.Ф., Иззо Р., Беллиньо А., Навари-Изцо Ф .: Долгосрочная и краткосрочная депривация фосфата в корнях бобов: изменения липидов плазматической мембраны и временная стимуляция фосфолипаз.Фитохимия 2007, 68: 1564-1571.
34. Хаммонд Дж. П., Беннетт М. Дж., Боуэн Х. С., Бродли М. Р., Иствуд, округ Колумбия, Мэй С.Т., Ран С., Сваруп Р., Вулэуэй К.Э., Уайт П.Дж.: Изменения в экспрессии генов в побегах арабидопсиса во время фосфатного голодания и потенциал для развития умных растений. . Физиология растений 2003, 132: 578-596.
35. Secco D, Jabnoune M, Walker H, Shou H, Wu P, Poirier Y, Whelana J: Пространственно-временное профилирование корней и побегов риса в ответ на фосфатное голодание и восстановление.Plant Cell 2013. doi: http: //dx.doi.org/10.1105/tpc.1 13.1 17325.
36. Байс Х.П., Притхивирадж Б., Джа А.К., Аусубель Ф.М., Виванко Дж. М.: Медиация устойчивости к патогенам путем экссудации антимикробных препаратов из корней. Nature 2005, 434: 217-221.
37. Миллет Ю.А., Данна С.Х., Клей Н.К., Сонгнуан В., Саймон М.Д., Верк-Райхарт Д., Аусубель Ф.М.: Врожденные иммунные ответы, активируемые в корнях Arabidopsis с помощью молекулярных паттернов, связанных с микробами. Растительная клетка 2010, 22: 973-990.
38.Muchhal US, Pardo JM, Raghothama KG: переносчики фосфатов из высшего растения Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93: 10519-10523.
39. Брутнелл Т.П., Ван Л., Свартвуд К., Гольдшмидт А., Джексон Д., Чжу XG, Келлог Э., Ван Эк Дж. Setaria viridis: модель фотосинтеза C4. Растительная ячейка 2010, 22: 2537-2544.
40. Малами JE, Бенфей П.Н.: Организация и дифференцировка клеток в боковых корнях Arabidopsis thaliana. Развитие 1997, 124: 33-44.
DOI: 10.1186 / 1471-2229-14-69
Цитируйте эту статью как: Alatorre-Cobos et al.: Усовершенствованная недорогая гидропонная система для выращивания арабидопсиса и других видов растений в асептических условиях. BMC Plant Biology 2014 14:69.
Отправьте следующую рукопись в BioMed Central и воспользуйтесь всеми преимуществами:
• Удобная онлайн-подача
• Тщательная экспертная оценка
• Отсутствие ограниченного пространства или платы за цветные рисунки
• Немедленная публикация о приемке
• Включение в PubMed, CAS, Scopus и Google Scholar
• Исследование, свободно распространяемое
Отправьте рукопись на Tpntral
www.biomedcentral.com/submit> _ciiuai
Установка файлов IPA с помощью AltStore на iOS
AltStore — один из все еще работающих инструментов, используемых для установки файлов IPA на iOS 13 и iOS 14. Cydia Impactor не работает с бесплатными сертификатами для загрузки приложений на ваш iPhone и iPad, но AltStore 1.3 устраняет эту проблему. Более того, AltStore может активировать и деактивировать приложения, а также подписывать IPA без компьютера с помощью AltDaemon.
Скачать AltStore
Начиная с версии 1.3, AltStore и AltServer выпущены с публичной поддержкой для установки пользовательских файлов IPA, содержащих приложения и игры. Загрузите файл IPA из Safari и отправьте его в AltStore, чтобы установить его, или выберите файл с диска iCloud на вкладке «Мои приложения». Доступны версии для Windows 10 и macOS.
1. Загрузите AltServer Windows или AltServer Mac.
2. Распакуйте загруженный «AltServer.zip».
3. Откройте AltServer.exe.
Загрузите AltStore Beta
Поскольку AltStore и AltServer выпущены как проект с открытым исходным кодом, Thunder7yoshi скомпилировал AltStore Windows для всех, кто заинтересован в использовании бета-версии с поддержкой подписи файлов IPA и добавления собственных источников на iOS.После установки приложение появится в виде значка в области уведомлений.
1. Загрузите бета-версию AltServer для Windows или бета-версию AltServer для macOS.
2. Распакуйте загруженный файл «AltServer.Beta.Build.rar» с помощью PeaZIP.
3. Введите пароль «Thunder7yoshi» для извлечения всех файлов.
AltStore IPA
Загрузите AltStore IPA
1. Установите приложение Filza на свое устройство.
2. Загрузите пакет AltStore IPA версии 1.4.
3.Отправьте загруженный файл Filza.
4. Дважды щелкните файл IPA для установки.
Что такое AltStore?
Приложение AltStore может устанавливать файлы IPA на ваше устройство iOS с помощью компьютера, используя ваш Apple ID и пароль. Из-за лицензирования некоторых зависимостей (созданных Джеем Фриманом), используемых AltStore, разработчик распространял программное обеспечение по лицензии AGPLv3 (с открытым исходным кодом). Более того, новейшая версия работает на iOS 14.
Используя программное обеспечение, вы можете повторно подписать и установить любое приложение с вашим Apple ID, загружать приложения через Wi-Fi с помощью AltServer, периодически обновлять приложения в фоновом режиме, чтобы предотвратить их срок действия (когда на том же Wi-Fi, что и AltServer), а также обрабатывать все обновления приложений через AltStore для Windows и Mac.
Бесплатный сертификат разработки позволяет установить до 3 приложений на устройство и подписать не более 10 идентификаторов. Каждые 7 дней после подписания вам нужно будет подключать iPhone к компьютеру и повторять процесс установки. Бета-версия также предлагает возможность активировать и деактивировать приложения простым перетаскиванием.
Более того, AltStore предлагает возможность деактивировать подписанные приложения, позволяя переключаться между приложениями (максимум 10) без ограничения в 3 приложения. Пользователи взлома могут также установить AltDaemon — демон подписи на устройстве, который действует как локальный AltServer, позволяя AltStore устанавливать приложения без компьютера.
Официальная бета-версия AltStore недоступна бесплатно для общественности, и только после поддержки Riley Testut на Patreon вы можете получить доступ к новейшей скомпилированной сборке. Почему важно использовать последнюю бета-версию AltStore? Начиная с версии 1.3 b2 вы можете установить любой файл IPA на прошивки iOS 14, iOS 13 и iOS 12.
AltStore 1.4 для всех посетителей! Эта бета-версия предоставляет давно запрашиваемую возможность обновлять приложения через Siri и приложение ярлыков, а также некоторые важные исправления ошибок.
Начиная с версии 1.4 AltStore предлагает виджеты на iOS 14. Теперь вы можете отслеживать, когда истекает срок действия каждого из загруженных вами приложений, прямо на главном экране, гарантируя, что вы никогда не забудете обновить их снова.
Хотите больше контроля над обновлением приложений в AltStore?
В iOS 14 AltStore теперь поддерживает обновление ваших приложений в фоновом режиме с помощью Siri и ярлыков — и вы можете точно запланировать, когда обновлять свои приложения с помощью автоматизации ярлыков.
AltDaemon, наконец, вышел из стадии бета-тестирования, и он повышает надежность и энергоэффективность! AltDaemon позволяет AltStore устанавливать и обновлять приложения без компьютера, и теперь он доступен для всех взломанных устройств через Dynastic Repo.Поддержка VoiceOver была улучшена во всем приложении, что особенно сильно повлияло на вкладку «Мои приложения».
Наконец, есть также обычные общие исправления ошибок и улучшения, завершающие это огромное обновление.
Как установить приложение AltStore на iPhone
AltStore — это просто изолированное приложение iOS, которое включает в себя всю логику для загрузки и обновления приложений через AltStore на AltServer и отправки их обратно на устройство.
1. Загрузите iTunes для Windows (не Microsoft Store).
2. Загрузите iCloud для Windows (не Microsoft Store).
3. Запустите AltServer, дважды щелкнув файл «AltServer».
4. Подключите устройство к компьютеру через USB.
5. Доверьте свой iPhone компьютеру (при необходимости).
6. Откройте iTunes и включите синхронизацию iTunes по Wi-Fi для своего iPhone.
7. Щелкните значок AltServer в области уведомлений, затем щелкните «Установить AltStore».
8. Введите свой Apple ID и пароль.
9.Подождите несколько секунд, после чего на вашем устройстве будет установлен AltStore.
10. Перейдите в Настройки → Общие → Управление устройством.
11. Доверяйте только что установленному сертификату с именем [Ваш Apple ID].
Как установить файлы IPA с помощью AltStore
AltStore увольняет приложения с вашим бесплатным сертификатом разработки и отправляет их в приложение AltServer, которое устанавливает удаленные приложения обратно на ваше устройство с помощью синхронизации iTunes WiFi. Чтобы предотвратить истечение срока действия приложений, AltStore может обновляться в фоновых приложениях при использовании той же сети Wi-Fi.
1. Откройте приложение AltStore Beta на своем устройстве.
2. Перейдите в раздел «Мои приложения».
3. Нажмите кнопку +, чтобы подписать и установить файл IPA.
4. Выберите пакет IPA с приложением.
Добавить репозиторий AltStore в Cydia
Вы всего в нескольких шагах от установки твика из Cydia Sources.