Как зайти в вк если заморожена страница: Как разблокировать страницу в ВК, если ее заблокировали для доступа

Содержание

что делать без номера телефона

ВКонтакте уже давно стала одной из самой популярной площадкой в интернете. Множество людей зарегистрировались здесь, чтобы общаться с друзьями и делиться своими новостями.

Но из-за того количества пользователей стали появляться и мошенники, которые хотят заполучить ваш аккаунт и использовать его в корыстных целях. Поэтому команда Vkontakte, чтобы вас защитить, блокирует ваш аккаунт. Сегодня мы расскажем что нужно делать, чтобы разблокировать свою страничку.

Почему заблокировали страницу ВКонтакте? За что? И на сколько времени?

Твою страницу ВКонтакте заморозили. Почему, за что? Причина всегда есть, без нее никого не блокируют. Для тебя она может быть неожиданной, ведь ты ничего плохого не делал. Но причина и срок блокировки всегда указаны на твоей странице, если войти на нее через полную версию сайта. Например, через браузер на компьютере. А через приложение ВК этого не видно.
Войти на страницу — это значит не просто открыть ее, а ввести логин и пароль от замороженной страницы. Только так ты можешь узнать, на сколько времени и за что она заблокирована.

Причина может быть указана такая: «Эта страница была заморожена за рассылку от Вашего лица таких личных сообщений…» или «Спамеры использовали Вашу страницу для массового вступления в группы в целях рекламы и раскрутки этих групп». Что это означает? Ты не заботился о своей безопасности ВКонтакте. Злоумышленники получили доступ к твоему паролю (в народе называется «взломали») и пользовались твоей страницей: рассылали спам или вступали в группы для накрутки числа участников. Нет другого способа остановить это, кроме как заблокировать тебя и заставить поменять пароль.

Если ты сам вступил в группу по заданию, за выполнение которого тебе что-то обещали, или ставил лайки (например, через VkTarget), или добровольно участвовал еще в какой-нибудь накрутке, ты сам виноват. Это запрещено и за это замораживают. Также тебя могли заблокировать за рассылку нежелательных сообщений, рекламы (кто-то на тебя пожаловался). Конечно, вместо тебя это могли делать злоумышленники, перехватившие твой пароль. Учти, что в следующий раз срок блокировки увеличится или тебя заблокируют навсегда.

Что делать, если заблокировали?

Сама по себе страница не разблокируется. Что именно нужно сделать для восстановления доступа, написано там же, где тебе сообщили о блокировке. Срок, на который тебя заблокировали, тоже там указан. Если с телефона ты этого не видишь, войди через полную версию ВК:

Как зайти на свою страницу через полную версию сайта ВКонтакте

Как узнать причину и срок блокировки? Если не видишь и думаешь, что тебе их не указали, войди на замороженную страницу со своим логином и паролем через полную версию ВК — тогда увидишь.

Не регистрируй новую страницу на тот же номер! Ты не сможешь восстановить доступ к той, которую заморозили (или это будет сложно).

Если твоя страница не была взломана, а просто заморожена за нарушение правил, войди на нее со своим логином и паролем. Выполняй инструкции, которые тебе будет давать сайт, и ты разморозишь страницу.

⛔ Сайт. Досудебная и судебная блокировки

Роскомнадзор может заблокировать любой сайт, содержащий запрещенную для распространения информацию, в досудебном или судебном порядке. В этом случае сайт внесут в Единый реестр Роскомнадзора, который ведется с 2012 года.

Досудебная блокировка возможна по ограниченному перечню оснований: при наличии на сайте детской порнографии, пропаганды наркотиков или суицида. Страницы попадают в реестр запрещенных сайтов на основании собственной инициативной проверки Роскомнадзора или по жалобе от других пользователей. Блокировка производится в три этапа:

Ведомство проверяет поступившие сведения и направляет уведомление для хостинг-провайдера.
После проверки хостинг-провайдер уведомляет владельца сайта о наличии запрещенных данных.
Если владелец не отреагирует на предупреждение, то сайт блокируется.

В дальнейшем владелец может обжаловать решение Роскомнадзора в судебном порядке.

Судебная блокировка на основании ФЗ «Об информации, информационных технологиях и о защите информации» происходит, если суд найдет запрещенную законодательством информацию на ресурсе. При блокировке сайта владелец не уведомляется заранее и узнает о блокировке только при получении уведомления от Роскомнадзора о включении в реестр. То есть в суде администратор сайта не присутствует, а решение выносится без его участия по результатам прокурорской проверки.

Законодательство не содержит четкого перечня информации, за которую сайт подлежит блокировке, поэтому вопрос решается судом в индивидуальном порядке. В понятие запрещенного контента включают следующие:

экстремистские материалы;
способы производства наркотиков и взрывчатки;
информация об азартных играх;
распространение персональных данных;
нарушение авторских прав;
продажа дипломов или больничных;
оскорбление чувств верующих;
сведения о застройке без указания данных о разрешительной документации;
пособия по нарушению закона: уклонению от уплаты налогов, от военной службы, неуплате кредитов, незаконному обналичиванию денег и манипуляциям с показаниями счетчиков.

Как могут наказать человека, оскорбляющего власть

Читать

Гигиена в интернете, или Кто следит за нами по ту сторону экрана

Подробнее

Что будет за выкладывание чужих фото в интернет

Смотреть

Что делать владельцу

Если сайт заблокировали, то нужно проверить его на наличие информации, нарушающей законодательство. Пользователю следует получить решение суда в отношении сайта и при желании обжаловать его. Также можно обратиться за защитой своих прав в правозащитные организации, которые позволяют отстаивать свою позицию перед Роскомнадзором.

Что делать, если страница взломана и заблокирована, не могу войти?

Если же страница была взломана, то, скорее всего, злоумышленники поменяли пароль и войти ты уже не можешь. Если ты сидишь в ВК с компьютера, нужно проверить компьютер антивирусом (если вредоносные программы остались, тебя снова взломают) и восстановить доступ (то есть разблокироваться).

Как восстановить доступ и сменить пароль, если не могу войти? Здесь все написано:

Восстановление доступа ВКонтакте

Для разблокировки нужен номер телефона, привязанный к странице. Если у тебя этого номера уже нет, смотри здесь:

Восстановление доступа, если номера телефона больше нет

Заражение вирусами

Отдельным видом блокировки является заражение компьютера или телефона вредоносным и просто нежелательным ПО, ограничивающим доступ на конкретные сайты. В таком случае достаточно будет проверить устройство на предмет заражения вирусами, руководствуясь соответствующими инструкциями.

Подробнее: Проверка телефона на вирусы Поиск вирусов на ПК без антивируса Онлайн-проверка на вирусы

Как разблокировать страницу с телефона, через приложение?

В телефоне ты видишь сообщение «Ваша страница заблокирована» или «Ошибка. Ваш аккаунт заблокирован». Советуем в этом случае не пытаться сделать что-либо с телефона, а сесть за нормальный компьютер, ноутбук или хотя бы взять планшет (но открывать не приложение, а полную версию сайта), и уже с него разблокировать страницу. Ссылку на инструкцию смотри выше.

Также на будущее не помешает узнать хотя бы об элементарных мерах безопасности. Тот, кто их соблюдает, не имеет подобных проблем: Безопасность ВКонтакте.

Если тебя взломали, нужно действовать быстро. Мошенники могут от твоего имени просить деньги в долг у твоих друзей. Вот инструкция, что делать, когда взломали: Что делать, если взломали страницу ВКонтакте.

Для входа в Контакт рекомендуем всегда пользоваться стартовой страницей «Вход» (VHOD.RU) — это поможет избежать попадания на мошеннические сайты, а сам процесс входа будет легким и быстрым. «Вход» помогает людям с 2010 года.

Как точно понять, что страница заблокирована?

На заблокированной странице ты видишь примерно такое сообщение:

Мы обнаружили на странице Танюшки подозрительную активность и временно заморозили её, чтобы вырвать из рук злоумышленников. Если у Вас есть возможность связаться с Танюшкой, сообщите ей, что её страница в безопасности, но нуждается в разморозке.

Или такое:

Страница была заблокирована по жалобам пользователей. Возможно, она была взломана.

Если ты внимательно это прочитал, то должен понять, что со страницей ничего не случилось, она не удалена. Просто все действия на ней приостановлены до момента, когда пройдет срок блокировки и хозяин страницы восстановит доступ (то есть ты).

А если ты просто заходишь к кому-то на страницу и видишь «Пользователь ограничил доступ к своей странице» или не можешь написать человеку в личку, то это совсем другое. Читай про это здесь: Как понять, что тебя заблокировали (занесли в черный список) ВКонтакте.

Когда страницу разблокируют, на ней все останется как было?

Да, на странице все останется как было, ничего не пропадет и не изменится. Но имей в виду, что если до блокировки на твоей странице хозяйничал взломщик, он мог что-то удалить или изменить. В любом случае тебе придется сделать выводы из случившегося и больше не попадать в такую ситуацию, когда твою страницу приходится блокировать.

Если взломщик удалил твои фотографии, их придется восстанавливать через службу поддержки — Как восстановить удаленное фото ВКонтакте (читать до конца).

Как узнать, кто заблокировал мою страницу?

Твою страницу заблокировала (заморозила) администрация ВКонтакте. Они могли сами заметить, что твоя страница нарушает правила, или это им мог подсказать кто-то из других пользователей через функцию «Пожаловаться». Тебе этого никак не узнать. Лучше прочитай правила пользования сайтом ВК и больше не нарушай их.

Если же у тебя другой случай — ты заходишь к человеку на страницу и видишь «Пользователь ограничил доступ к своей странице», то это значит, что он просто добавил тебя в свой черный список. Читай это: Как понять, что тебя занесли в черный список ВКонтакте.

Проблемы с подключением к сети

Гораздо хуже, когда вы подцепили вирус, который хозяйничает в вашей системе, и портит важные файлы. Одним из таких является системный файл hosts. Если вкратце, он используется для ручной настройки адресов узлов. Если вы мало знакомы с сетевой теорией, не стоит вдаваться в подробности. Отметьте для себя тот факт, что в случае некорректного содержимого этого файла, появятся проблемы с подключением к Интернет, и доступом на сайты.
Это касается и Вконтакте. Если вирус подменил файл Hosts, вы не сможете вообще зайти в социальную сеть. Или будете перемещаться на сайт злоумышленников. Тут будьте особо внимательны. Они полностью копируют дизайн ВК, чтобы вы не заподозрили неладное. Многие пользователи смело вводят свои учетные данные, и разумеется, они становятся доступны злоумышленникам. А что случается дальше, мы уже знаем (см. взлом вк). Страница блокируется.

Как вы уже поняли, нам необходимо исправить проблемы, связанные с файлом hosts. Пошаговую инструкцию вы найдете в материале — не открывается вконтакте.

Куда пожаловаться на блокировку страницы ВКонтакте?

Никуда не пожаловаться и смысла в этом нет. Регистрируясь на сайте ВКонтакте, ты согласился с его правилами (без этого создать страницу невозможно). В правилах четко написано, что ты несешь полную ответственность за сохранность своего логина и пароля. Даже если твою страницу заблокировали из-за «взлома», это твоя вина — ты невнимательно относился к безопасности. Если не понимаешь, как у тебя украли пароль, это может объяснить тебе специалист-компьютерщик. Бесполезно спорить с тем, с чем ты уже согласился.

Сетевые ограничения

Нередко причиной блокировки учетной записи ВК становятся сетевые ограничения, установленные законодательством или добавленные локально через редактирование файлов и определенные программы. Для их снятия в первую очередь стоит попробовать воспользоваться VPN, лучшие из которых представлены у нас на сайте.

Подробнее: Установка VPN на компьютер Настройка VPN на телефоне

Причиной блокировки ВКонтакте также может быть установленный на компьютере файервол, воздействие которого чаще всего распространяется на весь браузер. С процедурой настройки такого софта можете ознакомиться отдельно.

Подробнее: Отключение фаервола в Windows XP, Windows 7, Windows 8 и Windows 10 Отключение антивирусных программ

Нередко искусственную блокировку страницы устанавливают работодатели в локальной сети, делая бесполезными любые VPN и анонимайзеры. Об этом стоит помнить, если вы столкнулись с невозможностью посещения соцсети именно на рабочем месте.

Заблокировали (заморозили) страницу ВКонтакте. Что делать? Решение

Почему заблокировали страницу ВКонтакте? За что? И на сколько времени?

Войти на страницу — это значит не просто открыть ее, а ввести логин и пароль от замороженной страницы. Только так ты можешь узнать, на сколько времени и за что она заблокирована.

Причина может быть указана такая: «Эта страница была заморожена за рассылку от Вашего лица таких личных сообщений…» или «Спамеры использовали Вашу страницу для массового вступления в группы в целях рекламы и раскрутки этих групп». Что это означает? Ты не заботился о своей безопасности ВКонтакте . Злые люди получили доступ к твоему паролю и действовали ВКонтакте от твоего имени: рассылали спам или вступали в группы для накрутки числа участников. Нет другого способа остановить это, кроме как заблокировать тебя и заставить поменять пароль.

Что делать, если заблокировали?

Сама по себе страница не разблокируется. Что именно нужно сделать для восстановления доступа, написано там же, где тебе сообщили о блокировке.

Срок, на который тебя заблокировали, тоже там указан. Если с телефона ты этого не видишь, войди через полную версию ВК:

Как разблокировать страницу с телефона, через приложение?

В телефоне появляется сообщение «Ваша страница заблокирована» или «Ошибка. Ваш аккаунт заблокирован». Советуем в этом случае не пытаться сделать что-либо с телефона, а сесть за нормальный компьютер, ноутбук или хотя бы взять планшет (но открывать не приложение, а полную версию сайта), и уже с него разблокировать страницу. Ссылку на инструкцию смотри выше.

Для входа в Контакт рекомендуем всегда пользоваться стартовой страницей «Вход» (сайт) — это поможет избежать попадания на мошеннические сайты, а сам процесс входа будет легким и быстрым. «Вход» помогает людям с 2010 года.

Как точно понять, что страница заблокирована?

На заблокированной странице ты видишь примерно такое сообщение:

Или такое:

Страница была заблокирована по жалобам пользователей. Возможно, она была взломана.

На самом ли деле тебя заблокировали?

Когда страницу разблокируют, на ней все останется как было?

Могут ли мне присылать сообщения на заблокированную страницу?

Нет, не могут. Пока не разблокируешь страницу, люди будут видеть только

«Страница заблокирована» или «Пользователь удален» и ничего прислать не смогут.

Бесплатна ли разблокировка?

Да, разблокировка и восстановление доступа всегда бесплатны. Если тебе предлагают заплатить, отправить СМС, перевести куда-то деньги и тому подобное, то ты на 100% имеешь дело с мошенниками. Тебе только кажется, что они из ВКонтакте. На самом деле нет. Читай это от начала до конца:

Как узнать, кто заблокировал мою страницу?

Твою страницу заблокировала (заморозила) администрация ВКонтакте. Они могли сами заметить, что твоя страница нарушает правила, или это им мог подсказать кто-то из других пользователей через функцию «Пожаловаться» . Тебе этого никак не узнать. Лучше прочитай правила пользования сайтом ВК и больше не нарушай их.

На какой срок, на сколько времени блокируют страницу?

На столько, на сколько нужно. Если твою страницу заблокировали, срок блокировки тебе сообщили (плохо читаешь — твоя проблема). Этот срок зависит от серьезности нарушения и от того, первое это нарушение или уже нет. Как ты уже видел выше, в следующий раз время блокировки увеличится.

Можно ли разблокировать страницу раньше срока?

К сожалению, разблокировать страницу раньше указанного срока нельзя. Никак.

Что делать, если страница заблокирована навсегда?

Действительно, такое тоже бывает. Ты получаешь сообщение: «К сожалению, мы обнаружили злоупотребления, связанные с Вашей страницей, и она заблокирована навсегда». Подробнее об этом рассказано здесь:

Куда пожаловаться на блокировку страницы ВКонтакте?

Что делать, если все равно не входит ВКонтакте?

Другие инструкции

Стартовая страница «Вход» помогает от блокировок

Чтобы безопасно входить на сайт ВКонтакте и не попасться мошенникам, которые заманивают людей и крадут пароли, всегда пользуйся стартовой страницей «Вход» (адрес сайт). Поставь ее себе стартовой страницей и используй для входа каждый раз.

Все вредные начальники свято верят в одну непреложную истину. Что на работе человек должен… работать и соблюдать дисциплину! (какое мерзкое слово, но оставим вопрос морали, проблема в другом!)

Что делают эти падшие люди? Они блокируют социальные сети! Заблокировать Вконтакте для них ничего не стоит, но и наш брат, знаете ли, не лыком шит! Статья расскажет, что делать, если на работе заблокировали Вконтакте. Приступим.

ТРИ способа обойти блокировку.

1. Используем анонимайзер. Это просто. Эффективно. Небезопасно. Подойдёт практически любой, но я предпочитаю наиболее популярные, например hideme.ru, хамелеон, или пингвей (скриншот ниже)

Вот примерно так выглядит стандартное окно любого анонимайзера

Но у способа есть ДВА минуса :

1. Администратор на работе, скорее всего, заблокирует и их. В этом случае придётся искать новый анонимайзер. Появляются они часто.

2. Если используете какой то малопопулярный анонимайзер — то можете стать жертвой мошенников, будьте бдительны!

Другой вариант обхода “блокировки вконтакте” заключается в использовании ПРОКСИ-ЛИСТОВ

Это специальные посредники, доступ к нужному сайту (будь то ВК, одноклассники, или что угодно) осуществляется не напрямую, а через них.

Алгоритм действий:

1. Находим в поисковой системе список прокси серверов. (выглядят они так: site.ru 127.0.0.1 — т.е. УРЛ сайта и его IP, те что приведены здесь — всего лишь ПРИМЕР)

2. Заходим в настройки браузера, в закладки “сеть” (в опере) и вводим их (если будут вопрос — не стесняйтесь задавать их)

ТУРБО-режим браузера Opera

Он иногда позволяет зайти на заблокированные ресурсы. Это медленно, глючно и ненадёжно. Соломинка для утопающего. Тем более, в последних версиях этого бразуера этот режим вроде как отсутствует.

Что делать, если способы выше не помогают?

Тогда спросите себя: возможно я словил(а) вирус? Ведь решение здесь должно быть совсем другим. Материал для отдельной статьи, но вкратце:

1. проверьте ПК утилитой AVZ

2. удалите все упоминания о Вконтакте из файла hosts (C:\WINDOWS\system32\drivers\etc — для Win XP)

Интересное на блоге:

Как зайти в контакт если доступ закрыт? Этот вопрос тревожит немалое количество пользователей одной из самых популярных социальных сетей.

Нередко сидя в офисе или учебном заведении пользователи Вконтакте не могут открыть любимый сервис, хотя проблемы с подключением к сети отсутствуют. Это связано с тем, что руководство компании или ВУЗа блокирует доступ к сайту. Существует ли альтернативной способ вернуть доступ к социальной сети Вконтакте?

Как зайти в вк, если доступ закрыт

На сегодняшний день вопрос о том, как войти в контакт если доступ закрыт актуален среди пользователей сети. Это обусловило появление нескольких альтернативных способов решить проблему с входом на сервис.

Совет. Нередко доступ в ВК пропадает неожиданно, без всяких на то причин. Причиной тому могли стать вирусы, которые поменяли настройки Windows. Для устранения проблемы нужно проверить актуальные настройки.

Использование анонимайзеров

Как войти в вк если доступ заблокирован? Ответ предельно прост – воспользуйтесь специализированными сайтами анонимайзерами, которые позволяют обойти различные блокировки.

Одним из самых популярных сервисов является «Хамелеон». Пользователям достаточно зайти на сайт и ввести адрес социальной сети Вконтакте. По завершению процедуры доступ будет открыт.

Прокси-серверы

Еще один эффективный способ обойти блокировку социальной сети – настройка подключения через прокси-сервер. Для соединения проще всего использовать браузер Opera и его опцию Opera-Turbo.

Подключив данный функционал, абсолютно весь интернет трафик будет проходить через прокси-сервера, где в дальнейшем он будет сжиматься для более ускоренной загрузки страничек у конечного пользователя сети.

В том случае, если автоматический запуск прокси-сервера недоступен, воспользуйтесь ручной настройкой. Для этого необходимо выполнить следующие действия:

Зайдите в «панель управления» и нажмите меню «свойства браузера».
Перед вами откроется окно. Выберете опцию «подключения» и нажмите графу «настройка сети».
Перед вами снова откроется окно. В нем нужно обозначить параметры прокси-сервера: убрать отметку с графы «автоматическое определение параметров» и нажать отметку на графе «прокси-сервер для локальных подключений».
Укажите адрес сервера и обозначьте порт. Доступ к ВК открыт.

ВКонтакте — это сеть общения, где можно поддерживать связь со всеми своими родными и близкими людьми, а также находить новых друзей. На сегодняшний день почти каждый человек имеет свою страничку в ВКонтакте, но не каждый может присутствовать онлайн постоянно. Целый день могут позволить себе быть онлайн только те люди, которые работают на работе за компьютером. Особенно, если работа не требует очень большого внимания и время позволяет почитать новости, послушать музыку или поиграть в любимую игру. Но иногда

зайти ВКонтакт на работе невозможно из-за того, что руководители не приветствуют наличие свободного времени у своих сотрудников. Именно по этой причине вопрос заблокировали ВКонтакте на работе , что делать, возникает с каждым днем все чаще. Чтобы заказать качественную раскрутку групп и страниц ВКонтакте, перейдите по ссылке .

Закрыли ВКонтакте на работе как зайти?

Есть несколько способов решить проблему с входом в социальные сети на рабочем месте (читайте дополнительную информацию по теме блокировки ВКонтакте):

Использовать в этих целях свой телефон, если у Вас хороший тариф и соответствующий телефон;
Приносить с собой на работу свой ноутбук или планшет. Но в этом случае с собой необходимо иметь свой переносной интернет;
Также Вы можете использовать свой интернет (такой как 3G модем) на рабочем компьютере.

Но, как известно, все хотят легких путей и не заморачиваться с дополнительными проблемами. Так вот, как же быть, если вредные администраторы не идут на поблажки и на работе закрыли ВКонтакте ? В первую очередь все-таки можно попробовать лучше подружиться с системными администраторами и попросить их хоть иногда открывать доступ. Если все же не выходит, то есть один проверенный и хороший способ — это использование анонимайзер. Быстрая и безопасная накрутка подписчиков вгруппу ВКонтакте доступна .

На работе заблокировали Вконтакте как обойти?

Анонимайзер — это специальная ссылка, которая поможет Вам без особых затруднений пользоваться социальными сетями на рабочем месте и при этом Ваши системные администраторы не увидят этого. Чаще всего услуги данных прокси платная, но что не сделаешь ради общения ВКонтакте. При этом вход на сайт происходит обычным образом под своим логином и паролем, но иногда необходимо вписывать специальный код, который предоставляют администраторы сайта, которые помогают Вам в использовании анонимайзерами. Что делать, если ВКонтакте заблокировали злоумышленники, читайте в данной статье .

Необходимо также учитывать, что почти каждый системный администратор знает подобные хитрости и может себе позволить повлиять на Ваши планы. По этой причине многие сайты, которые предлагают эту услугу, присылают на почту еженедельно новые ссылки, по которым можно спокойно возобновить доступ к любимой социальной сети. Чтобы накрутить голоса в конкурсы, опросы или голосования, перейдите к данному разделу сайта.

Очень часто люди в рабочее время сидят в интернете. И вот они замечают в один прекрасный момент, что на работе заблокировали «ВКонтакте». И тогда им приходится очень долго думать, каким образом можно обойти данную неожиданную неприятность. Сейчас существует очень много разнообразных приемов. Какие именно? Давайте попытаемся выяснить вместе.

Договоренность

Для того чтобы решить наш вопрос, важно понимать, как заблокировать «ВКонтакте» на компьютере. А кто в офисе ответственный за фунционирование ваших операционных систем? Конечно же, системный администратор! И это наш шанс, который поможет ответить, как обойти заблокированный «ВКонтакте».

Попытайтесь найти с системным администратором общий язык. Если вам это удастся, то можете попросить его рассказать, как заблокировать «ВКонтакте» на компьютере. Разблокировка, как правило, происходит тем же самым образом. Крое того, вы всегда можете попросить администратора вернуть вам доступ к социальной сети тайно. Обычно сисадмины — люди сговорчивые и дружелюбные. Пообещайте, что будете осторожно использовать свой профиль, и вам, скорее всего, помогут. Если нет, то давайте думать дальше.

Анонимайзер

Не стоит бояться, что вам заблокировали навсегда «ВКонтакте» на работе. Дело все в том, что любой пользователь может с легкостью обойти данную неприятность. И при всем этом остаться незамеченным. О чем же идет речь?

Дело все в том, что если вам не удалось договориться с системным администратором, то вы всегда можете попытаться обойти блокировку при помощи специальных интернет-сервисов. Они называются анонимайзерами. Тогда вам не придется думать, почему заблокирован «ВКонтакте», и как решить проблему. Достаточно просто авторизоваться в социальной сети через анонимайзер, и все будет решено.

Найдите в интернете подходящий сервис. В нем в появившейся строчке наберите адрес социальной сети, а затем нажмите на кнопку «Войти». Далее можете пытаться пройти авторизацию в «социалке». Вот и все проблемы решены. Даже если у вас на работе заблокировали «ВКонтакте», вы сможете справиться с данной проблемой. Давайте же попробуем узнать, как еще можно решить данную задачу.

Чистим систему

Очень популярной социльной сетью стала «ВКонтакте». «Моя страница заблокирована, но можно ли решить проблему своими силами?» — задумавается интернет-пользователь. Можно! Даже без помощи анонимайзеров или разговоров с системными администраторами. Правда, для данного шага придется обладать некоторыми навыками.

Если на работе заблокировали «ВКонтакте», то вам потребуется найти один файл, который отвечает за работу сайтов на том или ином компьютере. Он называется «Host». С ним мы и будем работать.

У вас заблокировали страницу «ВКонтакте»? Что делать? Просто откройте «Мой компьютер» и найдите там системный раздел. Как правило, он называется «иск C». Откройте его и перейдите в папку «Windows». В ней заходите в «system32», далее — в «drivers», а затем — в «etc». Тут и будет необходимый нам документ.

Нажмите на него правой кнопкой мышки и откройте блокнотом. Чтобы долго не думать о том, что следует поменять в написанном тексте, просто сотрите все надписи, которые содержатся внутри «Host». Сохраните изменения, а затем посмотрите на результат. Как правило, этого достаточно.

Если нет, то перезагрузите компьютер. Теперь все будет работать исправно. Теперь вам известно, что следует делать, если на работе заблокировали «ВКонтакте». Но и это еще далеко не все варианты решения проблемы. Есть и еще несколько очень интересных способов. Какие именно? Сейчас мы с вами разберемся в этом деле.

Действие вирусов

Что ж, иногда блокировка страницы — это дело рук вирусов. И тогда начальник тут ни при чем. Заблокировали страницу «ВКонтакте»? Что делать, если причина в вирусе? Давайте разбираться.

В случае когда блокировка доступа происходит по вине вирусов, приходится работать с файлом «Host». Просто стираете все написанное в нем, а затем сохраняете. Но зачастую этого недостаточно. Вы можете попытаться просканировать компьютер на наличие вирусов, а затем очистить операционную систему. Если у вас на работе заблокировали «Вконтакте» вирусы, то можете поговорить об этом с системным администратором. Ведь это его работа — следить за целостью и сохранностью компьютеров.

Правда, вирусы — это сравнительно редкое явление на работе. Зачастую такая блокировка происходит по инициативе работодателя. Он делает это для того, чтобы его сотрудники нормально выполняли свою работу и не отвлекались. А значит, нам придется с вами думать, что еще можно предпринять.

Свои гаджеты

У вас «ВКонтакте» «Моя страница» заблокирована? Тогда можно прибегнуть к одной хитрости: сидеть в социальной сети со своих собственных гаджетов. Это может быть планшет или телефон. Главное — соблюдайте конспирацию. Если вас поймают, то, скорее всего, пользоваться гаджетами вообще запретят.

Еще одним очень важным моментом является то, что вы должны иметь собственный мобильный интернет на телефоне/планшете. Это защитит вас лишний раз от появления в списке подключенных устройств. Сейчас можно подобрать у сотовых операторов очень выгодные и недорогие тарифы.

На самом деле, если на работе заблокировали «ВКонтакте», то предпочтительнее всего будет использовать сотовый телефон. С ним риск возникновения «стычек» с начальством в несколько раз ниже. Правда, это далеко не единственный способ решения.

Не сидеть в социальных сетях

На работе заблокировали «ВКонтакте»? Тогда мы с вами попытаемся предложить вам еще один довольно интересный подход к решению поставленной перед нами задачи. О чем именно идет речь?

Да о том, что вы должны попросту не сидеть в социальных сетях на работе. Занимайтесь своими задачами, а вечером, дома, отдыхайте в «социалках». Может быть, спустя некоторое время вам разблокируют доступ к «ВКонтакте» на рабочем месте. По правде говоря, тут нельзя надеяться на доброту вашего работодателя. Лучше уж воспитать в себе «стальной стержень» и привычку отстраняться от интернета. Только это поможет вам справиться со своими соблазнами разблокировать «ВКонтакте».

Разговор с шефом

На самом деле, у вас есть еще один альтернативный вариант развития событий. Дело все в том, что если вам на работе заблокировали «ВКонтакте», то вы всегда сможете просто поговорить с ваших боссом. Попросите его разблокировать доступ к социальным страницам.

Довольно часто именно честный разговор может помочь исправить ситуацию. На самом деле правильно поставленный диалог решает большинство проблем, в том числе и с заблокированными страницами в интернете.

Однако далеко не все боссы способны доверять работникам. Можете просить шефа открывать вам доступ в социальные сети только в определенные моменты и на короткий срок, когда вы действительно очень сильно нуждаетесь в разговоре. К примеру, ждете вестей от близких родственников или рабочую информацию. Может быть, именно такой подход поможет вам пользоваться «ВКонтакте» на работе.

Заключение

Что ж, пришло время подводит итоги нашей статьи. Мы разобрались с вами, какими путями следует шагать, если у вас на работе заблокировали «ВКонтакте».

Как можете заметить, большинство из них требуют диалогов с работниками и боссом. На самом деле правильно поставленный разговор очень часто помогает решить большинство проблем.

Вообще, наиболее популярными методами борьбы с блокировкой социальных сетей на рабочем месте являются использование анонимайзеров и договоренность с системными администраторами. Кроме того, особо продвинутые пользователи могут применять вариант с зачисткой файла «Host» в системном разделе жесткого диска.

По правде говоря, на работе лучше заниматься только своими обязанностями. Тогда вы легко и просто сможете избегать проблем с социальными сетями. Только если начальник будет видеть, что его подчиненные занимаются делом, то и надобности в блокировании компьютеров от социальных сетей не будет.

Заблокировали страницу ВК — что делать, если мой профиль заблокировали?

Уже наверное, не найдется людей, которые бы не слышали о социальных сетях. Много людей проводят с удовольствием свое свободное время вконтакте. Но, неприятным сюрпризом может быть случай, когда заблокировали страницу вк. Часто пользователи даже не предполагают почему это произошло. А причин для блокировки может быть довольно много.

Что же делать, когда нет возможности войти на свой профиль вк и как возобновить вход на страничку? Об этом вы сможете узнать, прочитав материал данной статьи.

Причины блокировки странички

После того, как вы обнаружили, что ваша страница заблокирована, сразу же начинаете искать причину этого действия. Так, администрация сайта никогда этого не делает просто так, без причины.

Если вы не помните, что могло стать причиной блокировки, то вы всегда сможете увидеть информацию об этом во время входа на свой профиль. Но, для того, чтобы можно было увидеть такие данные, вам придется войти не в мобильную, а в полную версию сайта.

Если вы уже узнали, что заблокировали страницу в вк что делать для того, чтобы возобновить работу в любимой социальной сети? Для того, чтобы выяснить причину блокировки, введите в полной версии сайта логин и пароль во время входа в свой профиль.

После того, как вы войдете на полную версию сайта, вы сможете увидеть информацию о том, какая была причина блокировки, на какое время страница будет недоступной для вас.

Причина заморозки может быть такая, что мошенники зашли на вашу страницу и делали там что-то от вашего имени. В итоге вы получите сообщения следующего плана: «От вашего имени было отправлено сообщения личных сообщений» или же «злоумышленники использовали ваш профиль для вступления в группы, сообщества для того, чтобы подключить к вашей странице рекламу».

Несмотря на то, какое сообщение придет вам от администрации сайта, страница все же будет оставаться заблокирована. Это произошло из-за того, что не были додержаны вами меры безопасности.

Из-за этого, мошенники используют твой профиль для рассылки сообщений, подключения к разнообразным сообществам, которые содержат рекламу. Поэтому и администрацией сайта было принято решение, чтобы ограничить вход в систему, как для вас, так и для третьих лиц.

Как разблокировать свой профиль вк

Если вдруг вас заблокировали вк, то стоит помнить о том, что сама по себе данная страница не начнет нормально функционировать, необходимо ее разблокировать. Для того, что именно нужно сделать, чтобы возобновить работу на своем профиле, вам нужно войти на свою страницу и прочитать информацию в сообщении, которое было отправлено модератором сайта.

В данном уведомлении должна быть прописана инструкция действий при блокировке страницы, а также срок пока будет действовать для вас запрет входа в систему.

Для того, чтобы разблокировать страницу, если нет подробных инструкций, то тогда нужно сделать:

Войти в систему, перейти на страницу авторизации на данном сайте.
Ввести активный номер телефона в соответствующем поле.
Выбрать команду получения кода, которая находиться ниже графы для введения мобильного номера.
Отправить комбинацию, которую вы получили в сообщении.
После того, как откроется новое поле, ввести придуманный пароль и подтвердить свои действия.

После выполнения данных указаний, ваш профиль будет разблокирован. Теперь вы сможете снова общаться в данной социальной сети со своими друзьями и знакомыми.

Но, что, же делать, если меня заблокировали вконтакте, а номер телефона, который использовался вами во время регистрации, был изменен? Так, разморозить страницу можно и без номера мобильного телефона. Для этого стоит придерживаться следующей схемы:

войти на страницу авторизации данных для входа в систему;
открыть ссылку на другой, дополнительный номер телефона, которая размещена в правой части страницы;
после этого предстоит ввести номер телефона, который у вас активен в настоящее время и «привязать» его к своей странице;
ввести полученный код, который был отправлен на ваше мобильное устройство в соответствующей строке;
для подтверждения своих действий вам необходимо выбрать опцию «продолжить»;
ввести новый пароль и войти на свою страницу.

После этого вы сможете продолжать общение в любимой социальной сети уже с новым паролем.

Что делать, когда страницу невозможно найти?

Часто бывает, что вы хотите войти на свою страницу, а после входа в систему вы видите сообщение «страница не найдена». Такое происходит, когда вы, или же кто-то от вашего имени сделали серьезное нарушение правил сайта. Из-за этого ваш профиль модераторы заблокировали в вк, и возобновить работу на данном профиле будет намного сложнее.

Стоит отметить, что за какие-то небольшие погрешности, связанные с политикой работы на сайте, ваш профиль блокировать никто не будет, это делается администрацией и рассчитаны такие санкции на неопределенный срок.

Из-за того, что модераторы социальной сети сами заинтересованы в том, что в данной системе было зарегистрировано чем побольше пользователей, то они не будут отправлять в «бан» страницу пользователя, который не нарушал никаких правил.

В данном случае единственным способом разблокировки страницы будет ваше обращение в клиентскую службу поддержки сайта. Для того, чтобы сделать подобный запрос, необходимо на странице авторизации пользователя выбрать опцию «обращение в техническую поддержку». После открытия формы для заполнения вам стоит описать свою проблему. При этом, в обязательном порядке вам предстоит написать следующую информацию:

описать подробно все детали ситуации, которая сложилась;
при несправедливой блокировке, на ваш взгляд, необходимо довести, с помощью доказательств свою правоту;
если вы все выступаете в данной ситуации виновным лицом, и вас заблокировали вк обосновано, то необходимо в письме принести свои извинения за сложившуюся ситуацию.

Если вы хотите, чтобы ваш аккаунт был разблокирован, то при обращении за помощью к сотрудникам службы поддержки сайта, категорически нельзя в своем письме писать:

выражения грубой формы;
слова ненормативной лексики;
оскорбление на модераторов, из-за которых ваша страница была «заморожена».

При обращении в техническую службу поддержки пользователей сайта, клиенты, обычно получают позитивное решение по поводу разблокировки своего профиля. При этом, очень важно вести себя корректно.

Если вы будете соблюдать все эти нормы, то модераторы пойдут вам на встречу и скоро снимут ограничение к доступу на вашей странице. Но решение принимают именно сотрудники сайта. Поэтому, при обращении ваш результат зависит только от решения модератора.

Можно ли самостоятельно заблокировать страницу?

Пользователь имеет возможность удалять временно или навсегда свой профиль вконтакте. Также, если он хочет ограничить доступ к своему профилю только для определенного круга пользователей, то он может закрыть свой аккаунт для нежелательных гостей.

При этом в вашем профиле будет отображаться минимальное количество информации тем людям, для которых она будет закрыта.

Если же на ваш профиль поступили жалобы от других пользователей, то в данном случае администрация сайта крайне редко использует метод блокировки для нарушителей. Если же вы хотите, чтобы ваш профиль был заблокирован по определенным причинам, то стоит помнить, что сделать это невозможно в следующих ситуациях:

нельзя добиться от администрации сайта блокировки своего аккаунта, если вами не были нарушены правила пользования страницей в социальной сети;
если нарушение с вашей стороны все же было, но никто из модераторов его не заметил, то тогда соответственно не будет «заморозки» вашей страницы;
также нельзя добиться блокировки своего аккаунта, когда к нему нет доступа. Это можно сделать только после авторизации пользователя с помощью ввода пароля и логина для входа в систему.

Поэтому, совсем не рекомендуется самостоятельно добиваться блокировки своей страницы.

Время блокировки аккаунта

Но, что делать, если страницу в вк заморозили, сколько же времени придется подождать для того, чтобы возобновить работу в своем профиле?

Однозначного ответа на данный вопрос не существует. Все зависит от того, какое из правил сайта было вами нарушено. Если страница была разблокирована сразу после обращения в службу поддержки, то о том, что вы сможете снова работать на данном сайте, вы получите уведомление.

Когда профиль был вами же временно удален, то вы его восстановить сможете на протяжении семи месяцев в любое время. Стоит отметить, что после истекания данного срока, на страницу вконтакте уже зайти будет невозможно. Тогда для того, чтобы оставаться пользователем социальной сети, вам нужно будет создавать новый профиль.

Чтобы узнать, на какой срок ваша страница была

заблокирована модераторами сайта, вам необходимо перейти в полную версию сайта и прочитать сообщение, в котором предоставлена информация о причинах «заморозки» и также вписаны строки блокировки данного аккаунта.

Когда сотрудниками сайта было обнаружено повторное нарушение с вашей стороны, то срок действий повторных санкций будет немного длиннее.

Поэтому, чтобы модераторы сайта вам не заморозили страницу вк, всегда необходимо помнить о соблюдении правил во время работы в популярной социальной сети. Кроме этого, стоит часто проверять, не заходят ли злоумышленники от вашего имени в профиль вконтакте. При соблюдении всех правил работы и мер безопасности, ваша страница никогда не будет заблокирована сотрудниками сайта.

Как разблокировать страницу ВКонтакте

Эффективный способ, как разблокировать страницу в ВК?

17:00, 29 октября 2018

Как работать

Автор: Amelie

Сегодня ВКонтакте активно используется в коммерческих целях. Люди все чаще прибегают к различным запрещенным приемам для ускорения процесса продвижения, что зачастую приводит к бану. У каждого, кто попадал в подобную ситуацию, возникает вопрос, как разблокировать страницу ВК? И сегодня я дам на него ответ.

В каких случаях блокируют страницу ВК?

Как и любого другого сайта, у vk.com есть свои правила, нарушение которых и приводит к заморозке или блокировке аккаунта. В большинстве случаев, особенно если нарушение конкретного профиля зафиксировано впервые, страницу именно замораживают на определенный срок, а не банят навсегда. В таких ситуациях разблокировать ее куда проще. Если же в сообщении от администрации говориться о бане навсегда, тогда, увы, шансы на разбан сводятся к нулю.

Итак, вот список наиболее популярных причин блокировки:

Спам (рассылка личных сообщений или комментариев с целью рекламирования продукта). Смотрите о лимитах на отправку сообщений, в материале по ссылке.
Публикация запрещенных видео или фотоматериалов.
Массовая рассылка приглашений в группу и в друзья.
Размещение вредоносных ссылок.
Использование сервисов, искусственно увеличивающих счетчики активности (накрутка).
Упоминание таких сервисов или их рекламирование.
Оскорбления и т.д.

Это лишь наиболее распространенные причины. В большинстве случаев аккаунт будет заморожен. А вот если нарушение носит более серьезный характер (например, призывы к насилию, терроризму, экстремизму и т.д.), можно получить перманентный бан. Советую ознакомиться.

Как разблокировать?

Что делать, если страницу заблокировали? Правильно, необходимо восстановить к ней доступ.

Чтобы разблокировать страницу ВК, необходимо открыть сайт на ПК (именно десктопную версию сайта, а не мобильную). Дальнейшие действия зависят от причины и вида блокировки.

Последовательность разблокирования профиля следующая:

Авторизоваться под своим логином и паролем (чтобы появилось сообщение о бане).
Если указано время заморозки, дождаться ее окончания.
Ввести номер телефона.
Далее полученный в СМС код ввести в появившееся поле.
Указать новый пароль.
Прикрепить скан или фото документов, подтверждающих личность.
Прикрепить свое фото на фоне сообщения о блокировке.

Последние пункты требуются не всегда. Если вас впервые заморозили, без указания срока, то для восстановления доступа достаточно получить СМС-сообщение, ввести код и новый пароль.

Если вас заблокировали не в первый раз, то здесь уже администрация ВК может потребовать скан паспорта или вашу фотографию на фоне текущей сессии. Это куда проблематичнее, чем подтверждение через СМС. И если со сканом паспорта все намного проще, то личное фото может осложнить процесс разбана страницы. Фото должно быть четким, иметь хорошее освещение, чтобы ваше лицо было отчетливо видно. При этом на фотографии также должна быть видна и текущая сессия (сообщение от администрации сайта). Учитывая, что большинство камер не может одновременно сфокусировать и картинку экрана и то, что находится за его пределами, у большинства пользователей возникают трудности.

Поэтому, если вас неоднократно наказывали за нарушение правил сайта, лучше приостановить всю подозрительную деятельность или использовать другой аккаунт.

Вам будет интересно: “Бережёного бог бережёт: защитим от покушений страницу ВК“.

Как разблокировать страницу без телефона?

Бывают ситуации, когда у владельца замороженной страницы по тем или иным причинам нет возможности использовать свой телефонный номер. Что делать в таких ситуациях? – Восстанавливать страницу через функцию «Забыли пароль».

Как разблокировать страницу ВК без номера телефона:

Откройте десктопную Версию сайта ВК.
Нажмите «Забыли пароль».
Далее кликните по ссылке «Нажмите сюда».
Введите ссылку своего профиля.
Введите новый и старый номер, старый e-mail и пароль, привязанные к аккаунту.
Отправьте запрос.

Далее ваш запрос будет рассмотрен администрацией сайта, и они уже объяснят ваши дальнейшие действия.

Итог

Если ваш профиль заморожен, то вы всегда сможете восстановить к нему доступ. Если бан получен навсегда, то проще завести новый аккаунт. Сегодня я рассказал вам о том, как разблокировать страницу в ВК. Будьте осторожны и внимательны в своей работе, и не доводите ситуацию до бана. Надеюсь, статья была полезной.

А о том, как разблокировать свой номер в Телеграм, есть статья на нашем сайте.

Читайте далее:

Click to rate this post!

[Total: 1 Average: 5]

Меня заблокировали вконтакте что делать.

Если админ заблокировал доступ вконтакте за спам

Популярная проблема среди неопытных пользователей сети интернет – это потеря информации, халатное отношение к конфиденциальности своих паролей. Речь пойдет о том, как восстановить доступ к странице социальной сети «Вконтакте».

Я постараюсь собрать все необходимые инструкции в одной статье, вам потребуется всего лишь выбрать интересующий вариант из предложенных и следовать четким инструкциям, в этом и будет заключаться успех восстановления.>

Меня взломали вконтакте, что делать?

Как и всегда, начинаем с предыстории. Обычное утро, вы собираетесь на работу или учебу, садитесь попить чай и в этот промежуток времени хотите зайти на страницу Вконтакте, чтобы по быстрому просмотреть ленту и ответить на письма.

Но вот печаль, не получается войти, начинаете психовать и несколько раз подряд вводите свои данные и только спустя несколько минут начинаете понимать, что данные для входа точно верные, а войти все равно не получается. В этот момент в голову «бьет» вывод – вашу страницу взломали и изменили пароль.

Настроение заметно меняется, обычно пользователи начинают паниковать и кидаться на все форумы с мольбами о помощи, некоторые даже умудряются нанять «хакеров», только бы вернуть свою страничку. И крайне мало людей, которые самостоятельно начинают принимать меры по устранению обидной ситуации.

Моя цель помочь пользователям, которые задают себе вопрос, как самому восстановить страницу Вконтакте? Именно для вас я пишу эту статью и рекомендую перейти от слов к делу.

Ознакомьтесь с содержанием и выберете из списка свою ситуацию, если вы не смогли ничего подобрать, то пролистайте до самого конца и в комментарии опишите проблему, я максимально быстро отвечу и помогу разобраться, но только если вы являетесь истинным владельцем страницы.

Взломали страницу Вконтакте, что делать?

Итак, начинаем с самой глобальной проблемы, чаще всего страницы взламывают и меняют пароли для доступа, более изощренные взломщики могут умудриться заменить и номер телефона и адрес электронной почты, что дает им полный контроль над вашим профилем. Но решение проблемы в принципе одинаковое, следуем инструкции на картинках ниже.

Для начала заходим на главную страницу сайта и нажимаем ссылку «Забыли пароль?»

Перед вами откроется страница восстановления доступа, где вам нужно указать свой Логин для входа, кроме этого можно использовать E-mail или номер телефона, который привязан к странице и нажать кнопку далее

Скорее всего появится меню капчи, где вам нужно доказать системе, что вы не робот, введите в пустое поле те буквы и цифры, что будут изображены на вашей картинке:

После этого могут появляться разные окна с требованиями ввести информацию в целях той или иной информации, просто следуйте инструкции на экране и восстановите доступ к своей странице.

Если так получилось, что номер, который был привязан к странице уже выброшен и до совсем печальной ситуации у вас больше нет контроля над электронной почтой, которая указана в профиле. То вам следует подать заявку в службу тех.поддержки.

Чтобы написать в службу тех. поддержки в этом же меню восстановления внизу страницы есть ссылка на обращение:

Перед вами откроется анкета обращения, которую необходимо внимательно заполнить. Отнеситесь к этому максимально серьезно, именно от правильно заполненной информации будет зависеть откроют вам доступ к странице или нет.

После необходимо ждать ответа на номер мобильного телефона, который вы указали в качестве доступного.

Что делать, если страница Вконтакте заморожена

Тут нужно быть более внимательными, так как блокировку страницы можно разделить на два типа.

В первом случае вас заблокировали по инициативе службы безопасности социальной сети за совершение сомнительных действий.
А во втором случае у вас тоже вылетает страница с оповещением заморозки, но это уже может быть фальсифицированный сайт, то есть вам в компьютер попал вирус и вы не знаете о нем. А тем временем он переадресовывает все ваши запросы в нужное ему место и отправляет ваши данные злоумышленнику. В этом случае вы полностью виноваты сами.

Чтобы избежать проблемы, можно попробовать зайти в контакт с любого другого устройства и посмотреть вылетает ли там такое сообщение, если нет, то проблема в компьютере.

Популярность социальной сети в контакте привела к тому, что вместе с огромной аудиторий, использующей ее по прямому назначению для общения появилась также группа людей, которые преследуя различные цели проводит в сети действия, запрещенные правилами. Взламывают аккаунты, рассылают спам и мошенническими способами заставляют пользователей платить им деньги. Администрация сайта не может оставлять это без внимание и банит подозрительные аккаунты. Пользователи обижаются на администрацию и пытаются восстановить свою страницу в контакте. Данной статьей мы хотим помочь пользователям и рассказать о том, как разблокировать страницу вконтакте.

Для начала давайте разберемся в сути проблемы. Многие забаненые пользователи искренне недоумевают за какой спам из заблокировали, ведь они никогда ничем подобным не занимались. Скорее всего это так и есть. Но, на вас могли пожаловаться другие пользователи, воспользовавшись функцией «Оставить жалобу», которые решили вам таким образом «насолить». Или спам рассылался от вашего имени, точнее с вашей странички злоумышленниками, которые получили к ней доступ узнав пароль к ней. По понятным причинам мы не будем о них рассказывать, а скажем лишь о том, как от этого защищаться.
Во-первых, у вас на компьютере должен быть установлен антивирус с регулярно обновляемыми базами. Во-вторых, пароли нужно подбирать устойчивые к взлому, длиной не менее 8 символов, состоящие из цифр и букв в различном регистре. В третьих, проявляет элементарную бдительность в своих действиях в сети и не открывать подозрительные ссылки и программы, которые прислали вам незнакомые люди. Прежде чем вы начнете разблокировать страницу вконтакте, вы должны четко понимать, что доступ для вас закрыт администрацией вконтакте, а не злоумышленниками. Сделать это очень просто. Если вам предлагают отправить SMS на короткий номер, чтобы ваша страница снова заработала, а в тексте блокировки вы видите слова «валидация аккаунта», то это мошенники. Что делать в этом случае мы уже рассказывали в статье . Когда же вас заблокировала именно администрация в контакте за спам, то это будет выглядеть примерно следующим образом.

У вас не будут требовать отправить куда-то SMS. Максимум, что может понадобиться это только ввести номер телефона, чтобы на него пришел код подтверждения. Вот инструкция как разблокировать страницу вконтакте быстро и бесплатно в этом случае. Первым вариантом нужно воспользоваться, если вы при входе в свой аккаунт видите надпись «указан неверный логин или пароль», а вторым, если указаны другие причины блокировки и срок, когда она заканчивается.

Первый вариант.
Вам нужно открыть страницу вконтакте по адресу . В поле ввода написать логин, email, или телефон на который была зарегистрирована ваша страница и нажать кнопку «далее».

После этого вам предложат ввести код графической защиты с картинки, чтобы подтвердить, что вы являетесь человеком а не роботом.

Вводите код и жмете кнопку отправить. Вам предложат ответить на контрольный вопрос, например ввести вашу фамилию для восстановления доступа к странице.

На финальной стадии выведут страницу пользователя с изображением, установленным как аватар и спросят к ней ли вы хотите восстановить доступ.

Нажимаете «Да, это нужная страница». На ваш телефонный номер, привязанный к странице через несколько минут прийдет код, который нужно будет ввести в открывшуюся форму.

Если код введен верно, то откроется форма для установки нового пароля. В нее вводите новый пароль, повторяете его и нажимаете кнопку «сменить пароль».

Вам должно прийти на телефон сообщение о том, что пароль от вконтакте успешно изменен и будет указан ваш логин и новый пароль.

Теперь вы можете заходить на свою страницу.

Второй вариант.
Этот способ подойдет, если при попытке входа на свою страницу вы видите, что она заблокирована по жалобе пользователей, или за рассылку спама. Кроме того, указан строк на который вы заблокированы и приведены инструкции того, как разблокировать страницу вконтакте. Вам будет предложено перейти на страницу . Вам нужно будет указать адрес страницы вконтакте к которой вы хотите восстановить доступ и нажать кнопку далее.

В появившемся окне ввести старый и доступный номера телефонов (он может быть одним) и старый пароль после чего нажать кноку «Отправить заявку».

В открывшемся окне ввести код графической защиты с изображения и еще раз нажать на кнопку «Отправить». На указанный вами телефон будет отправлен код, который вам нужно будет ввести вот в таком окне.

Если все прошло успешно, то вы увидите следующее окно.

Как из него следует, доступ к своей странице вконтакте мы практически восстановили. На телефон должны прийти два сообщение. Первое с кодом для отмены, если вы передумаете восстанавливать доступ. И второе с вашим новым паролем и подтверждением того, что заявка на восстановление доступа одобрена. Теперь осталось только дождаться указанной даты и времени.

Если вас банили уже несколько раз, то для восстановления доступа вам может понадобиться ваша фотография, или копия удостоверяющего личность документа. Поэтому, после первого случая с вашей страницей, когда ее временно заморозили обязательно примите все необходимые меры, чтобы не допустить дальнейших банов. Просканируйте компьютер на предмет вирусов и смените пароль на в контакте. А мы желаем, чтобы ваши общение с друзьями не было омрачено внезапными отключениями аккаунта.

Статья рассказывает, как обходить чёрный список во «Вконтакте».

Навигация

Возможность отправлять неугодных пользователей в «Чёрный список » существует в социальной сети «Вконтакте », как и на любых других аналогичных ресурсах. Конечно, внести в такой список кого-либо, кто вам не нравится – это хорошо.

Но что делать, когда вас самих туда занесли по ошибке, например, ваш друг, и вам нужно исправить это? В сегодняшнем обзоре мы будем говорить, как удалиться из «Чёрного списка » в соцсети «Вконтакте » после того, как мы туда попали.

Как действует функция «Чёрный список»?

Для начала разберёмся, что такое «Чёрный список » во «Вконтакте », и как он работает. Нам будет полезно это знать, чтобы лучше понять вопрос.

Когда вас заносят в «Чёрный список », вы оказываетесь как бы забаненными. Пользователь, который вас заблокировал, ещё может просматривать вашу страничку, для него вы полностью остаётесь на виду. Но если вы зайдёте к нему на страничку, то всё, что вы сможете увидеть – это аватар и имя. Всё остальное будет вам недоступно, включая отправку сообщений.

Также вы увидите на странице заблокировавшего вас пользователя уведомление о том, что вам закрыт доступ к этому аккаунту. Это и есть «Чёрный список », в котором вы оказались, и возникает вопрос, а можно ли его как-нибудь обойти? Обычным способом сделать это невозможно, но мы попробуем воспользоваться другими методами, которые помогут нам выйти из «Чёрного списка ».

Способ первый. Как обойти «Чёрный список» во «Вконтакте»?

Обойти блокировку со стороны другого пользователя на сайте «Вконтакте » можно при помощи анонимайзера. Анонимайзер – это такая программа, которая позволяет подключаться к Интернету анонимно, скрывая при этом реальный IP-адрес пользователя. Тем самым, если вы, например, заблокированы по IP-адресу в каком-либо чате, форуме или сайте, то вы можете спокойно зайти туда через анонимайзер.

Также дело обстоит и с «Вконтакте ». Вы можете зайти через анонимайзер в свой аккаунт во «Вконтакте » и свободно получить доступ для просмотра странички того человека, который ранее ставил вас в «Чёрный список ». Но тут есть пара нюансов.

Как обойти черный список и как выйти из черного списка в Контакте

Во-первых, сайт «Вконтакте » может вычислить, что вы заходите под «левой» программой и принять вас за мошенника. Не исключено, что после этого ваш аккаунт временно заблокируют до выяснения обстоятельств.

Во-вторых, при помощи анонимайзера вы лишь только обойдете «Чёрный список », но не сможете удалиться из него. Ваш аккаунт так и останется в списке заблокированных у другого пользователя, и вам всегда нужно будет прибегать к помощи анонимайзера, чтобы обходить блокировку.

Скачать один из таких анонимайзеров вы можете по этой ссылке .

Способ второй. Как выйти из «Чёрного списка» в группах во «Вконтакте»?

Немного поговорим о том, что делать, если вас поставили в «Чёрный список » в какой-либо группе во «Вконтакте ». Попасть в бан лист сообщества не так уж легко, но тем не менее это случается. Правда, выйти из «Чёрного списка » группы тоже весьма непросто, и мы лишь покажем вам теоретический пример того, как это можно сделать.

Ваша задача добиться того, чтобы администратор сообщества прошёл по вашей ссылке. Ссылка должна быть такого вида: http://vkontakte. ru/groups.php?act=unban&gid=(id сообщества, в чёрный список которого вас поставили)&id=(id вашей странички ).

Вам нужно каким-либо образом добиться того, чтобы администратор группы, где вас забанили, прошёл по этому адресу. После этого вы будете удалены из «Чёрного списка » этого сообщества. На практике добиться этого сложно, но попытаться стоит.

Способ третий. Как удалиться из «Чёрного списка» другого человека во «Вконтакте»?

Как обойти черный список и как выйти из черного списка в Контакте

Удалиться из «Чёрного списка » вашего друга можно по тому же принципу, что был описан в предыдущем пункте. То есть вам нужно будет создать ссылку и попросить заблокировавшего вас пользователя пройти по ней.

Чтобы действовать более хитро, зарегистрируйте новый аккаунт, сделайте его таким, чтобы он был похож на настоящий. Либо попросите вашего знакомого, чтобы он помог вам. Суть дела заключается в том, чтобы войти в доверие заблокировавшего вас человека и передать ему ссылку. Ссылка выглядит таким образом: http://vkontakte.ru/settings.php?act=delFromBlackList&id=(id вашей странички) . После того как он пройдётся по этому адресу, вы будете удалены из его «Чёрного списка ».

Но наиболее реальный способ – это пообщаться с вашим знакомым и попросить разбанить вас. Если это ваш друг, и вы его чем-то обидели – извинитесь, в этом нет ничего плохого. Всегда проще договариваться с человеком, идти ему на уступки, нежели искать какие-то хитрые обходные пути, которые не всегда подействуют.

Видео: КАК ВЫЙТИ ИЗ ЧЕРНОГО СПИСКА ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ В КОНТАКТЕ?

Ежечасно социальная сеть “Вконтакте” пополняется новыми пользователями, тем самым увеличивая свою популярность и количество зарегистрированных человек. Зачастую, неопытные пользователи создают новые страницы, так как ввиду некоторых причин их страницы блокирует администрация сайта. Почему это происходит, как это избежать? Всё это вы сможете узнать в данной статье, а главным вопросом будет: “Что делать, если Вконтакте моя страница заблокирована?”.

Чаще всего, странице пользователей блокируют из-за рассылки сообщений одинакового содержания, то есть спама. Администратор не вчитывается в ваше сообщение, он просто видит, что его больше, чем положено, поэтому вашу страницу и замораживают. Также есть вероятность, что страницу могут заморозить из-за жалоб других пользователей, что зачастую происходит. В этом случае ничего не сделать, не если после одного раза, вас пытаются ещё раз заблокировать, тогда уже администрация начинает рассматривать конкретные причины жалоб. Также бывают случаи, когда взламывают страницу и начинают рассылать различного рода сообщения (спама). В этом случае вы никак уже не сможете повлиять на это, просто нужно поставить более сложный пароль, чтобы такого больше не было.

Как разблокировать страницу Вконтакте?

Для того чтобы разблокировать страницу Вконтакте необходимо нажать на кнопку “Разблокировать страницу”, затем на привязанный номер телефона к вашей странице, должен прийти код. После того, как пришёл код, его необходимо ввести. Далее, если вы ввели правильный код, нужно будет, сразу же, поменять пароль на новый. Далее всё как обычно.

Бывают случаи, когда у вас не привязан никакой телефон, но привязана почта, в таком случае вам придёт код на почтовый ящик. Надо будет взять код оттуда и выполнить те же самые действия, как и с телефоном.

Если у вас просят деньги за восстановления страницы – лохотрон, никогда не верьте таким сообщениям, Вконтакте – бесплатная социальная сеть.

Если вам помогла или понравилась данная статья, не забудьте поставить свой лайк , это поможет другим пользователям найти её быстрей. А я смогу узнать, что интересует вас больше всего, чтобы подготовить и написать еще больше интересных и полезных статей! С уважением, Вячеслав.

Один из самых частых вопросов у активных пользователей социальных сетей — как зайти на страницу ВКонтакте, если доступ закрыт?

При входе в социальную сеть ВК на Украине появляется сообщение «Доступ заборонено».
Ещё одна причина, по которой невозможен вход на личную страницу — блокировка сайта администратором. Такое часто встречается в офисах, когда работодатели хотят увеличить продуктивность труда, закрыв доступ к соцсетям или любым другим сайтам.

В настоящий момент имеются быстрые способы обойти блокировку сайта ВКонтакте, используя сайты-анонимайзеры.

Два способа зайти в ВК, если сайт заблокирован — вход через анонимайзер

Сайт-анонимайзер позволяет обойти ограничения системного администратора и получить доступ к необходимым сайтам. Одним из таких анонимайзеров является Cameleo.ru. Пользование данным сервисом абсолютно бесплатное.

После нажатия кнопки «Go» откроется окно, где следует ввести свои данные к аккаунту.

Сервису Cameleo.ru более 6 лет и он один из самых надёжных и проверенных.

Вход во ВКонтакте через анонимайзер Noblockme.ru

Для этого необходимо перейти на страницу ресурса и выбрать окно «ВКонтакте». В результате, произойдёт перенаправление на страницу сети, в обход блокировки ВК.

Пользование сайтом-анонимайзером, найденным случайно в интернете — потенциальная угроза. В последнее время участились случаи ловко спланированных действий злоумышленников, которые могут украсть данные к аккаунту и в дальнейшем снять деньги с телефона, путём отправки СМС. Это одна из актуальных проблем для пользователей социальной сети.

А что же делать, если ВКонтакте «Доступ закрыт» — как зайти? Одна из основных причин — аккаунт взломан.

Вход на персональную страницу социальной сети крайне популярен. Сайт посещают миллионы людей, что вызывает интерес недобросовестных личностей. Такие злоумышленники могут попытаться заполучить деньги у владельца страницы, рассылают спам, используют другие уловки.

Важно не вестись на провокации, не слать СМС со своего телефона. Нередко под видом сообщения закрытого доступа (ничем не отличимым от оригинального) или от имени приложений просят отправить СМС. Одно из самых известных таких приложений-пустышек — просмотр гостей и подобные, которые якобы показывают, кто посещал персональную страницу.

Фейковая страница имеет все те же элементы, что и настоящая. А вот уловки могут быть разные, вплоть до вирусов, а именно — уязвимость системного файла HOSTS, который отвечает за преобразование доменных имен в IP-адреса (решение ниже) на компьютере. В результате чего, возможен переброс на другие вредоносные страницы. Главное для мошенников, чтобы пользователь ввёл логин, а также пароль.

Далее, со взломанной страницы мошенники начинают рассылать спам. Они далеко не всегда меняют логин и пароль. Значит, при малейших подозрениях взлома страницы и сообщениях о рассылке спама, следует немедленно поменять и логин (телефон), и пароль.

Другие вероятные причины закрытого доступа ВКонтакте

Следующий вариант менее вероятный — попытка загрузки социальной сети приводит к ошибке 404 «Нет такой страницы». Если компьютер заражён вирусами, предлагается переход на подставную страницу социальной сети.

Чтобы решить проблему, как зайти, если «Доступ закрыт» ВКонтакте, на ПК или ноутбуке должен быть установлен антивирус с обновлёнными базами. Если проверка антивирусом не даёт результатов, это вовсе не значит, что на компьютере вирусов нет. Дополнительно проверить компьютер можно доступными в сети утилитами:

бесплатная ;
бесплатная .

Скачав первую утилиту, нужно выбрать режим защиты (усиленный, обычный), запустить программу, дождаться сканирования и отчёта. Программа создана специально для устранения вредоносных программ и вирусов, но она не работает как защита в режиме настоящего времени.

Важно помнить, что данные утилиты не могут защитить компьютер от многочисленных атак вирусов. Следует обязательно устанавливать на любой компьютер полноценные антивирусы.

После устранения вируса, не сразу удастся попасть на личную страницу, возможно произойдёт перенаправление на фейковый ресурс. Вирус вписывает лишние директивы в файл hosts . Его можно найти по адресу C:\Windows\System32\drivers\etc\hosts .

Запустив hosts блокнотом, следует убедиться, что в нём нет ничего, кроме строчки 127. 0.0.1 . Важно прокрутить страницу вниз, так как мошенники часто делают отступ, чтобы пользователь ничего не заметил с первого взгляда.

Если обнаруживаются дополнительные директивы, следует смело их удалять. Методы мошенников практически одинаковы для каждой социальной сети. Поэтому, в независимости от того, какую соцсеть предпочесть (Майл.ру, Одноклассники, ВКонтакте), важно сразу проверить файл hosts.

Так же можно вернуть содержимое файла hosts в значение по умолчанию, воспользовавшись помощью официального сайта поддержки Microsoft и предложенной утилитой.

ВКонтакте «Доступ закрыт» — как зайти

Проверить наличие интернет-соединения путём проверки доступа к другим веб-ресурсам.
Если соединение есть, следует попробовать зайти на сайт с разных браузеров (Опера, Гугл Хром и т. д.)
При отсутствии доступа запустить проверку компьютера на вирусы.
Проверить файл hosts на наличие изменённых директив.

Вся выше приведённая информация даёт возможность понять, почему нет доступа на страницу ВКонтакте. Используя рекомендации, можно выяснить причину отсутствия доступа и зайти в ВК, даже если он будет заблокирован вирусом или закрыт системным администратором.

Как заморозить свежие овощи

Перейти к рецепту

Сохраняйте вкус лета круглый год.

Лето — прекрасная пора для любителей овощей. Сад и фермерский рынок изобилуют свежими продуктами — помидорами, сладкой кукурузой, морковью, болгарским перцем, цуккини до максимума. К сожалению, это не длится. К ноябрю этот поток свежих продуктов иссяк, и они снова вернулись к товарам из супермаркетов.

Но есть и хорошая новость: если у вас есть морозильная камера, вы можете сохранить свежесобранный вкус. Заморозив часть своего урожая сейчас, вы можете наслаждаться домашними овощами всю зиму.

6 шагов по заморозке свежих овощей: давайте начнем с основ с этих 6 шагов

Подготовьте . Вымойте овощи и, если вы используете паровую корзину, нарежьте их до нужного размера. Я уточню различные требования для разных овощей.
Бланшировать (варить в кипящей воде) овощи перед замораживанием . Бланширование останавливает ферменты, поддерживающие процесс созревания. Он также помогает избавиться от грязи и бактерий, сохраняет питательные вещества и осветляет цвет. Используйте по крайней мере один галлон воды на фунт овощей. Варите их в воде одну-две минуты. (Примечание: если вы замораживаете помидоры, пропустите этот шаг)
Сразу после бланширования ненадолго опустите овощи в миску с ледяной водой, пока они полностью не остынут.
Слейте воду и высушите. Если вы не используете корзину для варки на пару, то на этом этапе отрежьте до желаемого размера.
Далее вы получите контейнер для морозильной камеры или противень. Сделайте один слой овощей и заморозьте их до твердого состояния.
После заморозки упакуйте их в пакеты для заморозки или используйте вакуумный упаковщик. Вы не хотите, чтобы они вступали в контакт с воздухом. Это приведет к появлению «неприятных» привкусов к тому времени, когда вы их разморозите.

Полезные советы:

Заморозьте овощи в течение нескольких часов после их сбора или покупки, чтобы после заморозки они имели наилучший вкус и текстуру. Выбирайте те, которые не повреждены и не имеют надрезов для заморозки.
Бланширование (кратковременное ошпаривание овощей кипятком или паром) необходимо практически для всех овощей, подлежащих заморозке. Он останавливает действие ферментов, которые могут привести к потере вкуса, цвета и текстуры. Бланширование очищает поверхность от грязи и организмов, осветляет цвет и помогает замедлить потерю витаминов. Он также делает овощи вялыми или мягче и облегчает их упаковку.
Время бланширования имеет решающее значение и зависит от овоща и размера . При побледнении стимулирует активность ферментов и хуже, чем при отсутствии побледнения. Чрезмерное бланширование приводит к потере вкуса, цвета, витаминов и минералов. Используйте один галлон воды на фунт подготовленных овощей. Положите овощ в корзину для бланширования и опустите в сильно кипящую воду. Накройте бланшер крышкой. Вода должна снова закипеть в течение 1 минуты, или вы используете слишком много овощей для кипячения воды. Начинайте отсчет времени бланширования, как только вода снова закипит. Поддерживайте высокую температуру в течение времени, указанного в инструкции к овощу, который вы замораживаете.
Оставьте 1/2 дюйма свободного пространства в верхней части мешков.

Вот разбивка по требованиям различных овощей.

Сельдерей: Сельдерей входит в список овощей, которые плохо переносят заморозку. Он будет вялым и может не сохранить свой цвет. Это не очень хорошо, если вы ищете хрустящую закуску или хотите добавить немного хруста в салат из макарон. Но если вы ищете аромат сельдерея в жареном блюде, приготовленной запеканке или супе, то это отличный вариант, чтобы добавить к этим блюдам предварительно нарезанный сельдерей. Обрежьте стебли сельдерея, а затем бланшируйте в течение 3 минут и выполните оставшиеся шаги. Если вы хотите мелко нарезать их перед заморозкой, вы можете сделать это или сделать это перед добавлением в блюдо. Они будут прекрасно храниться в вашем холодильнике до года.
Морковь: Вымойте, очистите и удалите верхушки. Нарежьте тонкими ломтиками, 1/4-дюймовыми кубиками или продольными полосками. Бланшировать небольшие целые моркови в течение 5 минут, нарезать кубиками или ломтиками в течение 2 минут и нарезать вдоль полосками в течение 2 минут. Быстро остудить, процедить, высушить и упаковать, оставив 1/2 дюйма свободного пространства. Запечатать и заморозить. *Убедитесь, что вы используете свежую морковь , иначе она будет иметь резиновый привкус, когда вы будете использовать ее позже. Они останутся свежими в течение года.
Цуккини/желтая тыква: Вымойте и нарежьте кабачки и/или кабачки до желаемого размера. Тогда вы будете бланшировать всего 2 минуты. Вы не хотите, чтобы он готовил больше, чем это. Перейдите прямо в ледяную баню, а затем заморозьте в один слой на противне. После заморозки вы можете переложить его в пакет для заморозки и снова заморозить. Это похоже на сельдерей в том, что вы не захотите использовать его в качестве гарнира, так как он потеряет часть своей твердости, но его можно добавлять в ваши любимые супы, соусы для спагетти и запеканки. Промаркируйте и поставьте дату на пакете, лучше всего использовать его в течение 3 месяцев, но он продержится дольше в морозильной камере, просто знайте, что чем дольше он там находится, тем он потеряет свой вкус.
Болгарский перец и лук: Это овощи, которые легче всего заморозить, потому что вам не нужно бланшировать и охлаждать их льдом. Просто нарежьте лук по желанию, а для перца: удалите стебли, семена и мембраны; режь их как хочешь. Затем разложите на подносе, чтобы они не касались друг друга. Поместите их в морозильную камеру, пока они не затвердеют, затем переложите в безопасный для морозильной камеры пакет с застежкой-молнией, выдавив весь воздух, или в вакуумный пакет.
Кукуруза: Вы можете заморозить целый початок кукурузы, просто очистив его, а затем (лично я разрезал бы его пополам, чтобы получить два мини-початка кукурузы), поместив его в пакет для морозильной камеры, выпустив как можно больше воздуха. и замораживание. ИЛИ вы можете бланшировать початки кукурузы в течение 2-3 минут, а затем дать им остыть, пока вы не справитесь с ними. Отрежьте ядра и поместите в литровый пакет, удалите воздух и заморозьте. Они могут храниться до года в морозильной камере.
Брокколи: Разрежьте брокколи на соцветия и стебли одинакового размера. Затем их нужно хорошо вымыть, чтобы смыть всю грязь. Когда вы бланшируете их, вам нужно будет добавить соль в воду. Бланшируйте в течение 3 минут, а затем переместите на ледяную баню. Затем обсушите их и переложите на противень, застеленный пергаментной бумагой. Заморозить на 1-2 часа, а затем переложить в пакеты для заморозки. Они прослужат до 1 года.
Картофель : Очистите и вымойте картофель. Затем я разделил их на четыре части и бланшировал 3-5 минут. Поместите их в ледяную баню на 5-10 минут, а затем нарежьте на любой размер, который вы хотите. Упакуйте в пакет для заморозки и удалите как можно больше воздуха.

Я использовал эти удобные держатели для сумок, чтобы сделать этот процесс еще проще!

Держатели для сумок (партнерская ссылка)

Овощные рецепты, которые мы любим!

Сэндвичи с круассаном для завтрака в морозильной камере
(Можно заморозить) Буррито для завтрака
Кесадилья для завтрака в морозильной камере, 4 вида
Полезные замороженные банановые лакомства

Ищете другие бесплатные рецепты? Подпишитесь на мою рассылку и следите за всеми последними обновлениями в Facebook, Twitter, Pinterest и Instagram.

Пока нет оценок

Как заморозить свежие овощи

Давайте начнем с 6 шагов, как заморозить свежие овощи. Картофель, кукуруза, морковь, сельдерей, брокколи и многое другое.

Печать Pin This

celery
carrots
bell peppers
onions
potatoes
zucchini
squash
corn
broccoli

Celery : Celery is in the list of veggies that just won не выдерживает заморозки. Он будет вялым и может не сохранить свой цвет. Это не очень хорошо, если вы ищете хрустящую закуску или хотите добавить немного хруста в салат из макарон. Но если вы ищете аромат сельдерея в жареном блюде, приготовленной запеканке или супе, то это отличный вариант, чтобы добавить к этим блюдам предварительно нарезанный сельдерей. Обрежьте стебли сельдерея, а затем бланшируйте в течение 3 минут и выполните оставшиеся шаги. Если вы хотите мелко нарезать их перед заморозкой, вы можете сделать это или сделать это перед добавлением в блюдо. Они будут прекрасно храниться в вашем холодильнике до года.
Морковь : Вымойте, очистите и удалите верхушки. Нарежьте тонкими ломтиками, 1/4-дюймовыми кубиками или продольными полосками. Бланшировать небольшие целые моркови в течение 5 минут, нарезать кубиками или ломтиками 2 минуты и полосками вдоль 2 минуты. Быстро остудить, процедить, высушить и упаковать, оставив 1/2 дюйма свободного пространства. Запечатать и заморозить. * Убедитесь, что вы используете свежую морковь, иначе она будет иметь резиновый привкус, когда вы будете использовать ее позже. Они останутся свежими в течение года.
Цуккини/желтая тыква : Вымойте и нарежьте кабачки и/или кабачки до желаемого размера. Тогда вы будете бланшировать всего 2 минуты. Вы не хотите, чтобы он готовил больше, чем это. Перейдите прямо в ледяную баню, а затем заморозьте в один слой на противне. После заморозки вы можете переложить его в пакет для заморозки и снова заморозить. Это похоже на сельдерей в том, что вы не захотите использовать его в качестве гарнира, так как он потеряет часть своей твердости, но его можно добавлять в ваши любимые супы, соусы для спагетти и запеканки. Промаркируйте и поставьте дату на пакете, лучше всего использовать его в течение 3 месяцев, но он продержится дольше в морозильной камере, просто знайте, что чем дольше он там находится, тем он потеряет свой вкус.
Болгарский перец и лук: Это овощи, которые легче всего заморозить, потому что вам не нужно бланшировать и охлаждать. Просто нарежьте лук по желанию, а для перца: удалите стебли, семена и мембраны; режь их как хочешь. Затем разложите на подносе, чтобы они не касались друг друга. Поместите их в морозильную камеру, пока они не затвердеют, затем переложите в безопасный для морозильной камеры пакет с застежкой-молнией, выдавив весь воздух, или в вакуумный пакет.
Кукуруза: Вы можете заморозить целый початок кукурузы, просто очистив его, а затем (лично я разрезал бы его пополам, чтобы получить два мини-початка кукурузы), поместив его в пакет для морозильной камеры, выпустив как можно больше воздуха и заморозив. ИЛИ вы можете бланшировать початки кукурузы в течение 2-3 минут, а затем дать им остыть, пока вы не справитесь с ними. Отрежьте ядра и поместите в литровый пакет, удалите воздух и заморозьте. Они могут храниться до года в морозильной камере.
Брокколи: Разрежьте брокколи на соцветия и стебли одинакового размера. Затем их нужно хорошо вымыть, чтобы смыть всю грязь. Когда вы бланшируете их, вам нужно будет добавить соль в воду. Бланшируйте в течение 3 минут, а затем переместите на ледяную баню. Затем обсушите их и переложите на противень, застеленный пергаментной бумагой. Заморозить на 1-2 часа, а затем переложить в пакеты для заморозки. Они прослужат до 1 года.
Картофель: Очистите и вымойте картофель. Затем я разделил их на четыре части и бланшировал 3-5 минут. Поместите их в ледяную баню на 5-10 минут, а затем нарежьте на любой размер, который вы хотите. Упакуйте в пакет для заморозки и удалите как можно больше воздуха.

Полезные советы:

Заморозьте овощи в течение нескольких часов после их сбора или покупки, чтобы после заморозки они имели наилучший вкус и текстуру. Выбирайте те, которые не повреждены и не имеют надрезов для заморозки.
Бланширование (кратковременное ошпаривание овощей кипятком или паром) необходимо практически для всех овощей, подлежащих заморозке. Он останавливает действие ферментов, которые могут привести к потере вкуса, цвета и текстуры. Бланширование очищает поверхность от грязи и организмов, осветляет цвет и помогает замедлить потерю витаминов. Он также делает овощи вялыми или мягче и облегчает их упаковку.
Время бланширования имеет решающее значение и зависит от овоща и его размера. Недостаточное побледнение стимулирует активность ферментов и хуже, чем отсутствие побледнения. Перебланширование приводит к потере вкуса, цвета, витаминов и минералов. Используйте один галлон воды на фунт подготовленных овощей. Положите овощ в корзину для бланширования и опустите в сильно кипящую воду. Накройте бланшер крышкой. Вода должна снова закипеть в течение 1 минуты, или вы используете слишком много овощей для кипячения воды. Начинайте отсчет времени бланширования, как только вода снова закипит. Поддерживайте высокую температуру в течение времени, указанного в инструкции к овощу, который вы замораживаете.
Оставьте 1/2 дюйма свободного пространства в верхней части мешков.

Сохраните этот рецепт на потом! Нажмите на сердечко в правом нижнем углу, чтобы сохранить рецепт в свой ящик!

Family Fresh Meals не является диетологом или диетологом, и любая предоставленная информация о питании является только оценочной. Мы рекомендуем прогонять ингредиенты через онлайн-калькулятор питания, если вам нужно проверить какую-либо информацию.

Курс:Гарнир

Кухня:здоровая, вегетарианская

Ключевое слово:tips

Вы приготовили этот рецепт? Отметьте меня в Instagram на @familyfreshmeals или оставьте внизу.

Шаги взяты с https://share.upmc.com/2014/06/6-steps-freeze-fresh-vegetables/

Reader Interactions

Структура комплекса TnsB-транспозаза-ДНК CRISPR-ассоциированного транспозона типа V-K

Новые результаты

Франсиско Тенхо-Кастаньо, Николас Софос, Бланка Лопес-Мендес, Луиза С. Штуцке, Андерс Фульсанг, Стефано Стелла, Гильермо Монтойя

doi: https://doi.org/10.1101/2022.08.05.502904

Abstract
Full Text
Info/History
Metrics
Supplementary material
Preview PDF

Abstract

CRISPR- ассоциированные транспозоны (CAST) представляют собой уникальные мобильные генетические элементы, которые кооптировали иммунные системы CRISPR-Cas для РНК-управляемой транспозиции ДНК. Тип V-K CAST состоит из Cas12k, TniQ, TnsC и TnsB. Здесь мы представляем структуру криоэлектронной микроскопии 2,46 Å Scytonema hofmannii CAST Транспозаза TnsB в комплексе с ДНК-переносчиком в посткаталитическом состоянии. Комплекс переноса цепи shTnsB поддерживает переплетенную архитектуру транспозосомы фага MuA. Однако построение сборки зависит от различных локальных взаимодействий. Комплекс белок-ДНК образует псевдосимметричную сборку, в которой 4 протомера shTnsB принимают две разные конформации. Распознавание концов транспозонов осуществляется двумя небольшими спиральными доменами. Два протомера, участвующие в реакции переноса цепи, имеют каталитически компетентный активный центр, состоящий из трех кислотных остатков (DDE), в то время как два других, которые играют ключевую роль в сложной архитектуре, имеют каталитические карманы, в которых остатки DDE расположены неправильно. для декольте. Количественная оценка in vivo анализ транспозиции мутантов в ключевых остатках связывания ДНК показывает, что отсутствие специфичности обычно снижает активность, но в некоторых случаях может увеличить транспозицию. Наша структура проливает свет на реакцию переноса цепи ДНК-транспозаз DDE и предлагает новое понимание РНК-управляемой транспозиции в системах CAST.

Введение

Открытие адаптивной прокариотической иммунной системы, называемой кластеризованными регулярно расположенными короткими палиндромными повторами (CRISPR), в которой повторы связаны с белками Cas (связанными с CRISPR), произвело революцию в науках о жизни. Системы CRISPR-Cas представляют собой весьма разнообразные комплексы рибонуклеопротеинов (РНП) с разным эволюционным происхождением. Они разделены на два класса, класс 1 и класс 2, первый из которых обладает многосубъединичным эффекторным комплексом, а второй — единственным эффекторным белком 9.0248 1 . Эти два класса далее делятся на шесть типов (I-VI) в зависимости от идентичности нуклеазного модуля и множество подтипов в зависимости от того, какие другие белки Cas присутствуют в других функциональных модулях. В частности, члены класса 2 привлекли большое внимание, так как они были разработаны в универсальные РНК-управляемые нуклеазы для РНК-управляемого редактирования генома, что радикально изменило науки о жизни, позволив манипулировать геномом в живых организмах ² .

Недавно было обнаружено, что несколько механизмов CRISPR-Cas связаны с Tn7-подобными системами транспозонов типов I, IV и V. Эти системы CAST ^3,4,5 являются продуктом эволюционного процесса, посредством которого транспозоны, подобные Tn 7 , по-видимому, «паразитируют» в системе CRISPR-Cas для мобилизации транспозонов. Эти комплексы RNP не разрушают свою ДНК-мишень и действуют исключительно у прокариот. Они вставляют большие ДНК-грузы (10–30 т.п.н.) в определенные области генома без необходимости направленной по гомологии репарации ^4,6–8 , сочетая точность выбора сайта CRISPR-Cas с интеграционными свойствами транспозонов ⁹ . Поэтому считается, что CAST представляют собой очень многообещающую систему для разработки инструментов редактирования генов следующего поколения.

Подтипы CAST I-F, I-B и V-K из Vibrio cholerae (vc), Anabaena variabilis (av) и Scytonema hofmanni (sh) соответственно были обнаружены первыми ^3,4, но недавние биоинформационные поиски в метагеномных базах данных значительно расширили известный репертуар CAST до более чем 1000 неповторяющихся подсистем, представляющих типы I, IV и V9. 0248 7 . На сегодняшний день все известные CAST происходят от Tn 7 -подобных транспозонов и включают соответствующие crРНК и гены Cas , необходимые для селекции мишеней ^{8, 39,7}, и основной механизм транспозиции внутри Tn 7 — как локус транспозона. Сюда входят гены TnsB, TnsC, TniQ (гомолог E. coli TnsD) и, в некоторых случаях, гены TnsA. По аналогии с системами транспозонов Tn7, белки CAST Tn 7 , как полагают, собираются в нуклеопротеиновый комплекс перед интеграцией, который включает TnsA (в типах I и IV), TnsB, TnsC и TniQ, чтобы регулировать транспозицию в инсерцию. сайт. TnsA — эндонуклеаза, расщепляющая 5′-концы транспозона 9.0248 10 и взаимодействует с TnsB, TnsC и ДНК ^10–12 . TnsB является рекомбиназой и катализирует расщепление 3’-концов транспозона. В канонической системе Tn7 взаимодействие TnsA и TnsB необходимо для активации катализа ¹³ . TnsC является частью семейства AAA+ ATPase и направляет TnsA/TnsB к сайту встраивания ^12,14 . Считается, что взаимодействие TniQ с ДНК-мишенью, связанной комплексом CRISPR-Cas, создает искажение в структуре ДНК, позволяя TnsC распознавать как TniQ, так и ДНК 9.0248 15 , что впоследствии привело к вставке транспозона в место прикрепления. Однако в системах CAST типа V-K отсутствует TnsA в их локусах, что делает механизм транспозиции неясным ^16,17 , поскольку неизвестно, как обрабатываются 5′-концы транспозона, чтобы продолжить интеграцию груза.

Транспозазы TnsB принадлежат к суперсемейству ретровирусных интеграз с каталитическим доменом рибонуклеазы H и мотивом активного сайта DDE. TnsB связывается с левым и правым концами транспозона и катализирует их расщепление, образуя свободные гидроксильные группы, которые позже используются в нуклеофильной атаке ниже последовательности-мишени ¹⁸ . Наконец, он выполняет реакцию переноса цепи, которая приводит к встраиванию груза ДНК в сайт прикрепления.

Транспозаза shTnsB имеет гомологию с другими членами семейства интеграз DDE, такими как E. coli TnsB, MuA и Tn5053 (дополнительная рис. 1). Структура TnsB E. coli (ec) в комплексе с концом транспозона предоставила новые доказательства, объясняющие различия в распознавании левого и правого концов элемента 9.0248 19 . Однако идентичность последовательностей ecTnsB с shTnsB низкая, что затрудняет понимание деталей механизма интеграции Tn7/CAST и других систем транспозонов, содержащих интегразы семейства DDE.

Чтобы понять, как shTnsB способствует РНК-управляемой транспозиции в системе CAST V-K, мы определили структуру комплекса shTnsB-ДНК, захваченного после реакции переноса цепи, с помощью крио-ЭМ одиночной частицы с разрешением 2,46 Å (рис. 1). Структура показывает запутанную архитектуру белка shTnsB вокруг ДНК, создающую псевдосимметричную сборку, в которой 4 субъединицы shTnsB могут быть сгруппированы в двух разных конформациях. ДНК в каталитических карманах DDE резко изгибается после реакции переноса цепи. Сайт-направленный мутагенез и 9Анализы транспозиции 0240 in vivo выявили важную роль в транспозиции ключевых ДНК-связывающих остатков. Реакционный комплекс переноса цепи shTnsB открывает новые возможности для понимания транспозиции, управляемой РНК, в системах CAST.

Рис. 1. Крио-ЭМ структура субъединицы CAST shTnsB, представляющая посткаталитическое состояние комплекса переноса цепи.

а) Общая схема реакции интеграции транспозаз семейства TnsB. На каждом конце активный сайт DDE катализирует атаку H9.0322 2 O на целевом сайте (1). Прямая атака 3’ОН груза ДНК на целевой участок ДНК способствует переносу цепи (2). Связывание с мишенью оставляет спейсер в 5 нуклеотидов между местами атаки. 5′-выступы удаляются и заполняются полимеразой. Структура представляет собой продукт переноса цепи (STC). б) Архитектура белка shTnsB. Полипептид состоит из N-концевого домена, который можно разделить на два субдомена (NTD1 и NTD2), каталитического домена DDE (DDE), среднего домена (MD), домена олигомеризации (OD) и С-концевого домена. (КТД). c) Карта плотности крио-ЭМ с глобальным разрешением 2,4 Å для TnsB (STC) в посткаталитическом состоянии (см. также рисунки 5–6 в приложении, таблицу 2 в приложении). Карта окрашена в соответствии с карикатурой, описывающей строение на панели d. г) Мультфильм ШТнсБ СТК. Комплекс состоит из 4 протомеров shTnsB и 6 олигонуклеотидов ДНК, представляющих посткаталитическое состояние ПТК (рис. 1а, стадия 3). Пунктирные линии изображают взаимодействие между MD и NTB1 из-за кривизны ветвей ДНК. д) Ленточная схема, отображающая общий вид сборки ШТнсБ СТК.

Результаты

Выделение shTnsB и создание комплекса переноса цепи (STC)

Рекомбинантный белок shTnsB был экспрессирован в E. coli и очищен с использованием комбинации аффинной и эксклюзионной хроматографии (SEC). Белок вел себя как мономер в SEC-MALS с молекулярной массой 68 кДа (дополнительная рис. 2a-b, методы). Мы проанализировали его ДНК-связывающие свойства с помощью EMSA, используя олигонуклеотиды с разным количеством коротких и длинных повторов (SR и LTR соответственно), присутствующих на левом и правом элементах (LE и RE) концевых последовательностей транспозона (дополнительная рис. 2c-d, Дополнительная таблица 1). Анализ сдвигов полос со всеми различными субстратами выявил лестницу дискретных полос, которая увеличивалась с концентрацией белка, предполагая связывание одного белкового мономера на повтор. Сборки выше 6 белков не наблюдались, поскольку их размер препятствовал попаданию в акриламидный гель (дополнительная рис. 2c). Затем мы проверили, может ли shTnsB независимо связывать RE или LE (дополнительная рис. 2d). Точно так же количество полос, наблюдаемых при смешивании shTnsB с RE, соответствует 5 сайтам связывания TnsB. Однако количество полос, наблюдаемых при смешивании shTnsB с LE, составило 4, т.е. на одну больше, чем ожидаемые 3 сайта связывания. Это можно объяснить взаимодействием двух комплексов shTnsB:LE, подобным тому, которое наблюдается в комплексе STC (рис. 1), или в других структурах транспозазы, не связанных с ДНК-мишенью, таких как Tn5-9.0248 20 . Однако агрегация комплекса shTnsB:LE также может вызывать сдвиг полосы и не может быть полностью устранена. Наконец, мы протестировали связывание shTnsB с двухцепочечной ДНК, содержащей только LTR (6) -SR (1) (дополнительная рис. 2e), и, как и ожидалось, обнаружили две полосы, соответствующие двум сайтам связывания shTnsB. Кроме того, мы инкубировали этот комплекс в буфере, содержащем различные концентрации NaCl, при 37 ° C и 45 ° C, чтобы определить, могут ли эти переменные изменить аффинность shTnsB. В целом, результаты EMSA показали, что shTnsB связывает каждый повтор, присутствующий как в RE, так и в LE, независимым от груза способом.

Первоначально мы подготовили сетки и собрали данные, используя образец, содержащий TnsB, а также RE и LE, не связанные друг с другом (дополнительный рис. 2e). Эта выборка была довольно неоднородной и страдала преимущественной ориентацией. Обработка этих данных привела к реконструкциям с низким разрешением недостаточного качества для построения атомной модели (дополнительный рис. 3). Однако можно было наблюдать два выступа, связанных с удлиненной плотностью, что свидетельствует о присутствии двух протомеров shTnsB, связанных с поверхностью двухцепочечной ДНК набора SR-LTR. Удлиненная плотность, приписываемая ДНК, изгибается таким же образом, как в недавно опубликованной структуре RE-связанного ecTnsB 9.0248 19 , что также подтверждает, что карта с низким разрешением соответствует комплексу перед транспозицией.

Чтобы стабилизировать комплекс shTnsB-ДНК, мы разработали олигонуклеотиды для восстановления STC, то есть состояния, представляющего посттранспозицию, а не претранспозицию, как описано выше (методы, дополнительная таблица 1). ДНК STC состоит из двухцепочечной ДНК LTR(8)-SR(5) и SR(1)-LTR(6), связанных с сайтом присоединения CAST. Расстояние в 5 п.н. между сайтами вставки LTR(8)-SR(5) и SR(1)-LTR(6) было выбрано, поскольку транспозиция CAST вызывает дупликацию 5 п.н. в сайте вставки 9.0248 21 (рис. 1а).

Восстановленная ДНК STC была смешана с очищенным белком, и сборка комплекса shTnsB-STC была проверена с помощью SEC-MALS (дополнительная рис. 2b). Наблюдали два пика: пик с более низкой молекулярной массой содержал несвязанный белок и ДНК, использованные при восстановлении, в то время как пик с высокой молекулярной массой, который элюировался при 358,7 кДа, очень хорошо совпадал с ассоциацией ДНК STC (104,6 кДа) и 4 протомеров shTnsB (68 кДа), теоретическая молекулярная масса которого составляет 376,6 кДа. Эта сборка была подвергнута анализу отдельных частиц с помощью крио-ЭМ, в результате чего была получена карта с разрешением 2,46 Å, на которой мы построили атомную модель комплекса shTnsB-STC в его посткаталитическом состоянии (рис. 1а) 9.0003

Общая структура комплекса shTnsB-STC

Белок shTnsB состоит из 6 различных доменов (рис. 1b) и напоминает архитектуру Mu-транспозазы (MuA) ²² , хотя идентичность последовательности ограничена каталитическим доменом DDE (Дополнительный рис. 1а). Мы собрали 4728 роликов и установили координаты для 9,6 млн частиц, которые после 2D-классификации сократились до 415 тыс. Используя этот набор частиц, мы выполнили неравномерное уточнение, трехмерный анализ изменчивости и последующее гетерогенное уточнение в cryoSPARC 9.0248 23 . Этот подход дал две карты на 2,5 и 2,8 Å. Дальнейшие этапы уточнения и трехмерного анализа изменчивости с использованием 260 тыс. частиц карты 2,5 Å позволили создать крио-ЭМ-карту с глобальным разрешением 2,46 Å, что позволило смоделировать комплекс shTnsB-STC (рис. 1c, дополнительная рис. 4-5, Дополнительная таблица 2 и методы). Однако большая гибкость ДНК поставила под угрозу визуализацию концов ДНК, содержащих SR (5) и SR (1), что не позволило определить возможные контакты с shTnsB (дополнительный рисунок 4-5, дополнительное видео 1 и дополнительная таблица 1) .

Структура комплекса shTnsB-STC напоминает удлиненный X с изогнутыми плечами. Более длинные концевые ДНК транспозона образуют нижние более длинные ветви, а изогнутая ДНК-мишень — верхние более короткие (рис. 1г-д, 2а). Четыре протомера shTnsB (shTnsB1-4) представляют собой переплетенную сборку на ДНК STC. Белок находится в двух разных конформациях, чтобы ассоциироваться с ДНК STC и строить комплекс (рис. 2b). shTnsB1 и 2 изображают вытянутую конформацию вдоль разветвленной структуры нуклеиновой кислоты, где мы не могли наблюдать домены OD и CTD (рис. 1б, г). В обоих протомерах каждый из доменов NTD1 и NTD2 связан с нижним концом элементов LTR(8) и LTR(6) соответственно, в то время как каталитический домен DDE визуализируется на стыке между ДНК-мишенью и концами транспозона противоположная ветвь (рис. 1в, 2б). Со стороны ДНК-мишени сборка стабилизируется за счет взаимодействия остова с доменами MD и DDE протомеров shTnsB1 и 2 (R416, Q427, K29).0, N428) (рис. 2б). Таким образом, shTnsB1 осуществляет распознавание ДНК на конце LTR8, а его домен DDE катализирует атаку 3’-ОН в ветви LTR(6) на ДНК-мишень, способствуя реакции переноса цепи. Симметричное расположение ДНК STC наблюдается для shTnsB2, который катализирует перенос цепи LTR(8) на другую цепь ДНК-мишени (рис. 1а, рис. 2б).

Рис. 2. Архитектура комплекса ШТнсБ СТК.

а) На верхней панели показана схема S. hofmanii подвижный элемент с левым и правым элементами (LE и RE) с каждой стороны ДНК-груза. Сильный цветовой тон показывает область каждого элемента, присутствующего в структуре. Нижняя панель не включает белковые фрагменты в структуру и показывает ДНК STC. ДНК окрашена по верхней схеме для LE и RE, а участок ДНК-мишени показан серым цветом. Желтые точки указывают сайт, где произошла прямая атака 3′-ОН на ДНК-мишень, чтобы способствовать реакции переноса цепи. b) Подробное изображение ассоциации протомера shTnsB с ДНК STC. Две различные ассоциации наблюдаются для молекул shTnsB. Различные участки ДНК, взаимодействующие с белками, показаны соответствующим ярким цветовым оттенком. c) Подробное изображение спиральных доменов NTD1 и 2, показывающее специфические взаимодействия с основаниями ДНК в области LTR(6). Маркировка нуклеотидов соответствует цветовому коду на рис. 1d-e (см. также рис. 1d и рис. 7 приложения).

Протомеры shTnsB3 и 4 расположены в другой конформации с небольшим количеством контактов с остовом ДНК (рис. 2б). Домены NTD1 и NTD2 этих протомеров в нашей структуре не наблюдаются, что позволяет предположить их высокую подвижность. Кроме того, домен DDE вытягивается из ДНК, в то время как MD размещает лоскутные области с концов LTR6 и LTR8 после катализа. Структура выявила важную роль этих двух протомеров в ассоциации shTnsB1 и shTnsB2 с ДНК, поскольку в этой конформации они демонстрируют упорядоченный домен OD. Эта спираль не наблюдается в shTnsB1-2, но в конформации, принятой shTnsB3-4, спираль облегчает сборку комплекса STC за счет переплетения NTD2 shTnsB1 и shTnsB2 с доменом DDE противоположного протомера в каждой ветви ДНК, тем самым связывая распознавание двух концов транспозона с каталитическими сайтами shTnsB1-2 (рис. 1г, 2б).

Распознавание ДНК shTnsB

Распознавание LTR(6) и LTR(8) осуществляется спиральными доменами NTD 1 и 2 субъединиц shTnsB1 и 2 (рис. 2в). Структура домена NTD1 обнаруживает спираль-поворот-спираль Myb/гомеодомен-подобную складку. Прямые контакты оснований с помощью спирали, связывающей большую бороздку, в основном объясняют специфичное для последовательности распознавание. Хорошо консервативный R77 образует полярные контакты с dG37, тогда как R81 связывается с основаниями последовательных нуклеотидов dG36 и dT37 на комплементарной цепи LTR6 в LE (дополнительные рис. 6, 7 и таблица 1 приложения). Другие остатки, взаимодействующие с ДНК (R58, R66, K84 и T78), обнаруживают полярные взаимодействия с остовом обеих цепей ДНК. NTD1 соединяется с NTD2 длинной петлей, которая проходит вдоль бороздки ДНК. Домен NTD2 функционально аналогичен второму ДНК-связывающему домену в других транспозазах. Однако он демонстрирует ограниченную консервативность, и его структура не связана ни с одним из ближайших гомологов shTnsB (дополнительный рисунок 1). Хорошо сохранившийся R99 в этой петле строит полярные взаимодействия с основаниями dT31, dA32 и dA45, в то время как R106 также распознает основания dT30 и dT46 в разных стойках. Остальные ассоциации петли с ДНК включают остовные контакты. Домен NTD2 также связывается с ДНК в большой бороздке. Однако он отображает меньше конкретных контактов с базами. Только R158 и K154 связываются с dA48-dG49 и dG24 соответственно, тогда как остальные остатки связываются с остовом нуклеиновой кислоты. Эти взаимодействия аналогичны в доменах NTD1 и 2 на ветвях LTR (6) и LTR (8) комплекса белок-ДНК (дополнительная рис. 6-7).

Сборка комплекса белок-ДНК

Домены NTD2 субъединиц shTnsB1-2 соединены с доменами DDE длинной петлей. Переплетающаяся конформация этих протомеров с ДНК позволяет shTnsB1, который распознает ДНК в LTR(8), катализировать реакцию переноса цепи на конце LTR(6), и наоборот для shTnsB2 (рис. 1c, 2b). Этому перекрестному расположению каталитических доменов DDE способствует конформация молекул shTnsB3-4, которые стабилизируют сборку за счет интеркалирования длинной двудольной спирали, которая собирает домены NTD2 и DDE разных субъединиц. Соседний MD вмещает 5′-лоскуты, образовавшиеся после реакции переноса цепи (рис. 1d, рис. 3a-c). С-концевая спираль OD плотно прилегает между доменом DDE shTnsB2 и NTD2 shTnsB1 сетью контактов, сочетающих полярные и неполярные взаимодействия (рис. 3б), причем первая на конце (E360-K520 ) средний (R367-D512-Q508) и конечный (S505-h372) участки спирали. Другое сильное полярное взаимодействие наблюдается между боковыми цепями D514 в OD и R137 в NTD2. Короткая петля соединяет этот участок с N-концевой спиралью OD. Взаимодействие второй спирали OD с доменом DDE стабилизируется за счет неполярных взаимодействий, а группа остатков в MD shTnsB3 (R416, Q425, N428) вместе с R174 и R179в shTnsB2 образуют электроположительно заряженную область, стабилизирующую основания 5’-выступа (рис. 3в). Наконец, домены MD и DDE протомера shTnsB3 связаны с NTD1 shTnsB2, главным образом, группой неполярных взаимодействий. Интересно, что N-концевая β-цепь shTnsB2 встроена как дополнительная нить в антипараллельный β-лист MD (Fig. 3d). Дополнительные полярные взаимодействия боковых цепей (E422-K169, N462-K102 и E54-h383) дополняют эту ассоциацию. В целом, ассоциации, описанные здесь, очень похожи в случае shTnsB4 с shTnsB1 и 2. Интересно, что мы отмечаем, что не наблюдается никакого взаимодействия между shTnsB3 и 4 в комплексе shTnsB-STC.

Рисунок 3. Сборка протомеров shTnsB.

а) Обзор архитектуры протомеров shTnsB и взаимодействий между двумя типами конформаций, наблюдаемых для белка на одной из ветвей ДНК STC (прозрачно). Цветные овалы обозначают увеличенные области на других панелях. b-c) Детальный вид взаимодействия OD shTnsB3 с доменами NTD2 и DDE shTnsB1 и 2 соответственно. d) Увеличение области LTR(6), изображающее ассоциацию N-концевого β-листа NTD1 с MD shTnsB3.

В совокупности эта сеть взаимодействий вдоль Х-образного комплекса предполагает, что различная конформация протомеров shTnsB3 и 4 способствует архитектуре сборки, которая способствует перекрестному взаимодействию, таким образом связывая распознавание LTR(6) и LTR(8) Последовательности ДНК по протомерам shTnsB1 и TnsB2 с катализом ДДЭ в противоположной ветви.

Каталитический домен DDE

Транспозазы из нескольких суперсемейств обладают каталитическим доменом, содержащим триаду кислых аминокислот (DDE или DDD). Каталитический домен DDE был идентифицирован в транспозазах 11 из 19в настоящее время признаны надсемейства ²⁴ . Этот белковый модуль катализирует реакцию транспозиции, при которой элемент вырезается из донорского сайта и вставляется в геном или в мобильный генетический элемент. Мутации в этих каталитических остатках показали их критическую роль в транспозиции в доменах DDE транспозаз Tn5 и Tn10 ^25,26. Интеграция элементов в новое место генома обычно приводит к короткой дупликации сайта-мишени из последовательностей хозяина (2–10 п. н.). В shTnsB мотив DDE состоит из двух остатков аспарагиновой кислоты (D205, D287) и остатка глутаминовой кислоты (E321), расположенных в консервативном ядре, образующем характерную РНКазу Н-подобную складку, объединяющую α-спирали и β-цепи (рис. 4а, дополнительный рис. 7). Трехмерная структура триады ДДЭ образует каталитический карман, который связывается с ионами двухвалентных металлов, помогающими в различных нуклеофильных реакциях во время расщепления ДНК. Домены DDE 4 молекул shTnsB в сборке очень хорошо накладываются друг на друга (среднеквадратичное отклонение 0,59).Å среднеквадратичное значение более 160 Cα). Однако карман DDE демонстрирует два различных расположения в зависимости от конформации протомера shTnsB в комплексе STC (рис. 1). DDE-карманы shTnsB3 и 4 не контактируют с ДНК и каталитическими остатками этих субъединиц и не расположены должным образом для реакции расщепления (рис. 4б). В случае shTnsB1 и 2 они обнаруживают каталитический карман DDE после завершения реакции переноса цепи. Можно визуализировать дополнительную плотность в кармане (рис. 4а), которую можно отнести к H ₂ O или Mg ²⁺ . E321 находится на расстоянии 6 Å, так как структура захватывается в посткаталитическом состоянии. Расстояния дополнительной плотности до D205, D287 и фосфатов основной цепи позволяют предположить, что плотность может быть отнесена к молекуле H ₂ O, образующейся после 3′-OH атаки одной из цепей мобильного элемента на ДНК-мишень. (Рис. 1а, 4а, дополнительный рисунок 7).

Рисунок 4. Каталитический центр DDE shTnsB.

а) В обведенной области находится один из каталитических центров в комплексе shTnsB-STC. Увеличение области показывает конформацию каталитического центра после катализа. Предполагаемая молекула воды и расстояния до соседних каталитических остатков и ДНК показаны в Å. b) Наложение доменов DDE двух конформаций, обнаруженных в комплексе белок-ДНК для shTnsB. c) Суперпозиция доменов DDE shTnsB2 и 3 с ecTnsB (PDB:7pik) и основным доменом MuA (PDB:1bco). СКО для суперпозиции находятся в диапазоне от 0,7 до 1,2 Å для 160-250 Cα. d) Нижняя панель показывает, что, несмотря на большое структурное сходство доменов DDE, единственной субъединицей во всех этих структурах, обладающей компетентным каталитическим карманом, является shTnsB2, единственная связанная с ДНК.

Несмотря на различия в последовательностях, новая структура комплекса конечного узнавания транспозона Tn7 ecTnsB транспозазы ¹⁹ обеспечивает близкий функциональный гомолог для сравнения. Домен DDE является наиболее консервативным модулем shTnsB, и поиск гомологов shTnsB DDE с использованием DALI ²⁷ выявил домены ecTnsB и транспозазы фага Mu как наиболее близкие гомологи вместе с различными вирусными интегразами (SRV, HIV-1, ВТЛВ-1). Сравнение двух конформаций shTnsB с этими белками показало, что ядро домена очень хорошо накладывалось на другие интегразы (рис. 4c), но только каталитический карман shTnsB2 показал кислую аминокислотную триаду на соответствующих расстояниях для катализа нити. реакция переноса. В остальных случаях каталитические остатки располагались неправильно (рис. 4г). Примечательно, что протомеры ecTnsB в комплексе распознавания концов имеют конформацию, сходную с протомерами shTnsB3 и 4 в STC. Однако в последнем ДНК-связывающие домены этих двух субъединиц не визуализировались (рис. 1-2), что позволяет предположить, что высокая гибкость, наблюдаемая в дистальных отделах ДНК STC (дополнительное видео 1), нарушает их связывание с SR. (1) и SR(5) области LE и RE.

В совокупности структурное сравнение позволяет предположить, что домен DDE сохраняет очень хорошо консервативную трехмерную структуру, однако сравнение различных структурных гомологов предполагает, что архитектура каталитического кармана транспозазы устроена должным образом после ее связывания с ДНК-мишенью.

Связывание ДНК транспозазами shTnsB, ecTnsB и MuA

Белок shTnsB проявляет гомологию с транспозазами ecTnsB и MuA. Однако, помимо домена DDE, между ними сохраняется несколько остатков (дополнительная рис. 1). Эти различия особенно очевидны в ДНК-связывающих доменах, где множественные выравнивания последовательностей из нескольких канонических белков Tn7 TnsB и различных классов CAST-элементов показали существенные различия ¹⁹ . NTD1 shTnsB демонстрирует значительное трехмерное сходство с доменом HTH DBD1 в ecTnsB (RMSD 2,4 Å для 66 Cα) и доменом Iβ MuA (RMSD 2,8 Å для 62 Cα). Тем не менее, присутствие N-концевой β-цепи (N32-T36) исключает shTnsB, и эта область играет важную роль в построении сборки комплекса STC (Fig. 3d). Эта структурная особенность не наблюдается в комплексе MuA STC ²², единственной доступной до сих пор структуре комплекса прокариотических транспозаз STC (Fig. 5).

Рисунок 5. Сравнение ДНК-связывающих доменов shTnsB, ecTnsB и MuA.

ДНК-связывающие домены трех различных транспозаз выровнены по ДНК (PDB:8AA5, 7PIK и 4FCY соответственно). В случае MuA показаны одни и те же домены, связанные с разными повторами. Для shTnsA построены только домены протомеров 1 и 2. В случае ecTnsB изображен ДНК-связывающий домен одной из субъединиц концевого комплекса.

Интересно, что домен NTD2 shTnsB не проявляет трехмерного сходства с его эквивалентными доменами в транспозазах ecTnsB и MuA (Fig. 5). Вместо этого NTD2 хорошо сочетается с Pax6, транскрипционным фактором, содержащим двудольный спаренный ДНК-связывающий домен (RMSD 2,8 Å для 60 Cα), который играет важную роль в развитии глаза, носа, поджелудочной железы и центральной нервной системы ²⁸ . Удлиненный линкер, соединяющий NTD1 и 2, частично визуализируется в ecTnsB и не наблюдается в ДНК-связывающих доменах MuA (рис. 5). Этот линкер образует контакты малой бороздки, а карбоксиконцевая единица спираль-поворот-спираль образует контакты основания в большой бороздке, как это наблюдается в комплексе shTnsB-STC (Fig. 5).

Сравнение позволяет предположить, что белки TnsB имеют общий общий способ связывания ДНК, включая два домена, которые распознают разные элементы SR и LR в сборке. Однако домены, участвующие в связывании, претерпевают различные структурные изменения для осуществления специфических взаимодействий белок-ДНК для каждой транспозазы. Это разнообразие может быть необходимо для размещения последовательностей большого количества Tn7-подобных элементов, предотвращая распознавание транспозазами последовательностей ДНК, принадлежащих другим транспозонам ²⁹ .

Комплексы STC

Структура концевого комплекса ecTnsB предоставила информацию о распознавании концов транспозонов ¹⁹ , но до сих пор нет структурной информации об их комплексе STC. Однако конформация субъединиц ecTnsB в концевом комплексе напоминает расположение, принятое доменом DDE протомеров shTnsB3 и 4 в комплексе shTnsB-STC. Однако положения MD- и OD-доменов ориентированы по-разному (рис. 4в). Тем не менее, эта конформация сильно отличается от архитектуры протомеров 1 и 2 shTnsB, которые участвуют в катализе реакции переноса цепи (рис. 2б). Конформация этих субъединиц больше похожа на аналоги в комплексе MuA-STC (рис. 6а).

Рисунок 6. Анализ комплексов переноса цепи shTnsB и MuA.

а) Комплексы shTnsB-STC и MuA-STC показаны в той же цветовой схеме, что и на рис. 1, за исключением ДНК, окрашенной в белый цвет. b) Обведенные кружками области на обоих комплексах сравниваются, чтобы показать ключевые различия в сборке комплексов STC.

Хотя последовательность shTnsB отдаленно связана с транспозазой фага MuA (дополнительная рис. 1), общая ассоциация комплекса MuA-STC имеет сходство с белком CAST (рис. 6a). Однако сборка также имеет важные отличия. Одно из основных отличий заключается в том, что в комплексе MuA-STC ДНК-связывающие домены субъединиц, участвующих в сборке (MuA 3 и 4), связаны с соответствующими повторами в LE и RE (рис. 6а), а в ШТнсБ-СТЦ их нельзя было смоделировать, что свидетельствует об их высокой гибкости. Это мнение подтверждается высокой изменчивостью, наблюдаемой в дистальной части Х-образной структуры ДНК (дополнительное видео 1). Тот факт, что эти области структуры MuA-STC ²² участвуют в кристаллических контактах, могут снижать гибкость, облегчая тем самым связывание доменов Iβ и Iγ с повторами на концах LE и RE.

Интересно, что ассоциация уникальной N-концевой β-цепи NTD1 в shTnsB не наблюдается в MuA (рис. 6б), поскольку этот элемент вторичной структуры отсутствует ни в Iβ-домене MuA, ни в DBD1 ecTnsB . Это наблюдение предполагает, что в комплексе ecTnsB-STC эта ассоциация не может происходить. Другое важное отличие возникает из-за сборки комплекса: домен OD в shTnsB интеркалирует с множественными взаимодействиями между NTD2 и каталитическим доменом DDE, создавая ассоциацию между белками shTnsB. В случае MuA ассоциация между 4 протомерами в этой области комплекса STC отличается, показывая значительно меньше взаимодействий между различными доменами (Fig. 6b). Кроме того, в протомерах 1 и 2 комплекса shTnsB-STC домены OD не наблюдаются, тогда как в случае MuA спирали в домене IIIα перекрещиваются внутри V-образного участка ДНК-мишени (рис. 6а). . Нельзя было не учитывать возможность того, что взаимодействие между этими спиралями в структуре MuA происходит за счет кристаллических контактов.

Эффект связывания ДНК при транспозиции

Чтобы подтвердить взаимодействие shTnsB:ДНК в STC, мы протестировали транспозиционную активность ряда мутантов с заменой, в которых консервативные аминокислоты, демонстрирующие полярные взаимодействия с ДНК, были заменены аланином (рис. 7, дополнительный рис. 1). Мы мутировали R77, R81 (оба присутствуют в NTD1), R99 (присутствуют в линкере между NTD1 и NTD2), R158 (присутствуют в NTD2), R188, R223, K290 и R380 (присутствуют в домене DDE) (рис. 7b). . Мутанты R77A, R81A и R158A продемонстрировали драматический эффект на активность транспозиции на мишени, указывая на то, что shTnsB больше не может распознавать повторы в RE и LE (Fig. 7b). Интересно, что нуклеотиды, участвующие в этом взаимодействии (дополнительная рис. 6), сохраняются между различными повторами, что еще раз подтверждает важность этого взаимодействия в распознавании ДНК донора ²¹ . Что касается R99, хотя он и присутствует в неупорядоченной области shTnsB, он тесно взаимодействует с фосфатным остовом и основаниями LTR. Эти нуклеотиды также сохраняются в наборе повторов RE/LE ²¹ . Однако эффект его замены был переменным: повторы демонстрировали либо более высокую, либо более низкую активность, чем дикий тип. В случае R223A и R380A это также повлияло на активность. Эти остатки, по-видимому, участвуют в стабилизации состояния после транспозиции. R223 взаимодействует с центральными нуклеотидами последовательности из 5 п.н. между разрывами, образованными в результате транспозиции, тогда как R380 взаимодействует с нерасщепленной одноцепочечной ДНК транспозона, расположенной вне комплекса. Наконец, несмотря на свою консервативность и близость к сайту прикрепления, мутанты R188A и K290A не отменял целевую транспозицию. Наши результаты подтверждают функциональную важность этих остатков, участвующих в распознавании LTR и стабилизации STC, и указывают на возможные сайты для улучшения свойств транспозазы для целей инженерии генома.

Рис. 7. Анализ транспозиции in vivo и количественная оценка методом ПЦР.

а) Транспозицию проводили путем трансформации бактерий плазмидой, содержащей сайт-мишень, показанный зеленым цветом, распознаваемым Cas12k:sgRNA (pTarget), плазмидой, содержащей донорную ДНК с последовательностями CAST RE и LE, показанными красным (pDonor) и плазмиду, содержащую кодирующие последовательности sgRNA, Cas12k, TnsC, TniQ и TnsB (pHelper). Интеграцию донорной последовательности в pTarget количественно определяли с помощью количественной ПЦР с использованием набора праймеров, амплифицирующих область pTarget, в которой не происходит транспозиции (PF 9).0322-мишень и PR _{-мишень}) и набор праймеров, которые амплифицируют область между целевой и донорной последовательностями LE (продукт PF _{и продукт} PR ). b) Положение выбранных аминокислот в STC, подлежащих мутации и тестированию на транспозиционную активность. c) Кратность изменения активности, измеренная с помощью количественной ПЦР для каждого мутанта TnsB. Полосы представляют собой среднее значение, а усы представляют собой стандартное отклонение. Также показаны отдельные точки данных. Активность дикого типа представлена пунктирной линией.

Обсуждение

В недавних исследованиях были описаны новые системы CRISPR-Cas, которые связываются с Tn 7 белками, подобными транспозонам ^17–19,7 . Эти CAST-системы задействуют механизм CRISPR-Cas и «паразитируют» на нем, чтобы направить интеграцию ДНК в специфический локус ⁴ . CAST сочетают в себе точность выбора сайта CRISPR-Cas с возможностью интеграции больших грузов ДНК с помощью оборудования Tn 7 . В прокариотических системах CAST отсутствует система адаптации (Cas1-Cas2) и нуклеаза Cas3 типа I, необходимые для деградации ДНК-мишени. Неизвестно, как их crРНК созревает, но процессированная crРНК собирает RNP, делая возможным связывание ДНК под управлением crРНК, но не способное вмешиваться. CAST типа V-K представляет собой минимальную систему, состоящую из белка, родственного Cas12, который строит RNP с crРНК и тремя белками, родственными Tn7: TniQ, TnsC и TnsB. Система типа В-К из S. hofmannii катализирует РНК-управляемую транспозицию ДНК путем однонаправленной вставки сегментов ДНК ниже протоспейсера и может интегрировать ДНК в целевые сайты в бактериальных геномах ²¹ . Таким образом, CAST расширяют наше понимание функционального разнообразия систем CRISPR-Cas и устанавливают парадигму точной вставки ДНК. Неактивные эффекторные комплексы CRISPR-Cas в большей части систем CAST относятся к системам CRISPR класса 1, которые собираются в большие мультисубъединичные комплексы. Основным исключением на данный момент является тип V-K, который представляет собой одну из наиболее многообещающих систем для разработки инструментов редактирования генов из-за уменьшенного размера неактивного эффектора Cas12k, состоящего из одного белка (639).остатки) и sgRNA (254 нт).

В прошлом году значительно расширились знания о структуре систем CAST ^30–33 . Доступна структурная информация TnsC, TniQ и Cas12k типа V-K ^34–36, а также каскадного комплекса типа I-F, связанного с TniQ ^37,38. Однако, несмотря на эти достижения, есть ключевые компоненты, участвующие в транспозиции, и их комплексы, о которых у нас нет подробной молекулярной информации. Кроме того, нам необходимо точное понимание последовательности взаимодействий и промежуточных звеньев, ведущих к точной вставке ДНК-груза, чтобы решить возможную разработку систем CAST. Это отсутствие полного понимания того, как транспозиция осуществляется с помощью различных CAST, препятствует их повторному использованию для точной вставки ДНК в инструменты редактирования генов.

В этой рукописи мы определили структуру белка S. hofmannii TnsB CAST типа V-K. Единственный компонент, по которому до сих пор не было доступной структурной информации. Комплекс shTnsB-end с низким разрешением (дополнительная рис. 3) предполагает, что распознавание концов транспозона очень похоже на ecTnsB ¹⁹; однако высокая гетерогенность и гибкость сборки не позволили провести детальную молекулярную характеристику распознавания ДНК. Это согласуется с экспериментами в системе Tn7, которые показали, что пре-транспозиционный комплекс менее стабилен, чем пост-транспозиционный комплекс, и что защита транспозонов меняется между пре- и посткаталитической стадиями ^39,40 . Кроме того, эксперименты EMSA предполагают, что shTnsB может взаимодействовать с RE и LE в прекаталитическом состоянии в отсутствие ДНК-мишени (дополнительная рис. 2). Т.о., взаимодействие shTnsB с концами транспозона, по-видимому, не зависит от присутствия др. компонентов системы CAST, таких как TnsC, который, как было показано ранее, взаимодействует с TnsB ³⁴ .

Более высокая стабильность посткаталитических комплексов привела нас к сборке комплекса shTnsB-STC, который мы смогли определить с высоким разрешением. Этот комплекс представляет собой стадию после завершения реакции переэтерификации с ДНК-мишенью, проявляющую ее трехмерную сборку в посткаталитическом состоянии. Общая структура напоминает архитектуру транспозомы 9 фага MuA.0248 22 . Тем не менее, ключевые различия между сборками можно наблюдать, особенно в домене NTD2 (Fig. 6). Одно возможное сходство между shTnsB и MuA, которое может отличить их от системы Tn7, заключается в том, что типы V-K и Mu могут использовать репликативную транспозицию, которая требует расщепления только одной цепи ДНК, в то время как Tn7 выполняет реакцию вырезания и вставки. , включающий расщепление неперенесенной цепи TnsA. Следовательно, структурное сходство общего комплекса STC между shTnsB и MuA будет поддерживаться этими механистическими сходствами. Тем не менее, мы ожидаем, что комплекс Tn7-STC должен содержать TnsA. Из нашей структуры неясно, как 5′-концы могли обрабатываться в системе Tn7.

Посткаталитическая структура shTnsB-STC выявила очень мало оснований-специфических контактов белок-ДНК (дополнительная рис. 6), как это также наблюдалось в прекаталитическом комплексе ecTnsB ¹⁹ . Домен NTD1 в shTnsB частично разделяет свою архитектуру с аналогами в ecTnsB и MuA, в то время как NTD2 уникален в том смысле, что он имеет структурную гомологию с фактором транскрипции Pax6 (Fig. 5). Единственной структурной особенностью shTnsB является N-концевая цепь, которая используется для связи узнавания в одном из плеч транспозона с каталитическим центром на противоположном сайте и наоборот, независимо от того, оказывает ли эта особенность некоторую аллостерическую регуляцию в каталитическом сайте DDE, остается быть определенным.

В то время как имеется структурная информация о катализе ДДЭ из других семейств транспозаз (структура Ref Tn5 и т. д.), структура shTnsB проливает свет на каталитический карман ДДЕ семейства TnsB, поскольку разрешение транспозосмы MuA препятствует подробному изучению каталитический сайт ²² . Две субъединицы shTnsB, участвующие в реакции, демонстрируют кислотную триаду в посткаталитическом состоянии. Атака 3′-ОН цепей транспозона 5′ ДНК-мишени оставляет несвязанные основания (dT62 и dA63) в каждой цепи и молекулу воды, связанную с остатками аспарагиновой кислоты и остовом ДНК (дополнительная рис. 6) . На основании структуры shTnsB-STC и структуры концевого комплекса ecTnsB можно заключить, что активный карман белков TnsB не приспособлен для катализа до связывания ДНК-мишени (рис. 4г). Скорее всего, это механизм предотвращения неспецифического расщепления.

Tn7 и CAST типов I-B и I-F полагаются на TnsA и TnsB для интеграции транспозонов ^49,41 Как упоминалось ранее, TnsA отсутствует в системах CAST типа V-K. Следовательно, формирование сборки TnsA-TnsB-TnsC, которая происходит в элементах Т7 и, как предполагается, происходит и в других типах CAST, не должно присутствовать в S. hofmannii Type V-K. Тем не менее, С-конец shTnsB (рис. 1б) содержит неструктурированный сегмент, взаимодействующий с shTnsC 9.0248 34 , как и в случае системы Т7 ⁴² , что позволяет предположить, что по крайней мере эти два белка образуют сборку, указывающую, где происходит интеграция. Однако отсутствие TnsA в типе V-K приводит к дальнейшим вопросам, касающимся промежуточного разрешения интеграции, поскольку нерасщепленные 5′-концы транспозона приводят к продуктам коинтеграции транспозиции ^43,44 . Транспозоны, полагающиеся на DDE-транспозазы, имеют разные механизмы для решения этой проблемы ^45–47 . Например, Tn5053 содержит резолвазу TniR, которая использует res сайты, также присутствующие в транспозоне, для расщепления коинтеграта ^48,49, в то время как другие транспозазы генерируют шпильки для вырезания оставшейся ДНК ⁵⁰ . Кроме того, репликация ДНК может разрешить коинтеграт в случае репликативной транспозиции ^47,50 . Как тип V-K CAST справляется с коинтегратным разрешением, до сих пор неизвестно. Тем не менее, некоторые факты предполагают, что ему может понадобиться резольваза, специфичная для хозяина. Во-первых, несмотря на то, что тип V-K CAST присутствует в виде единственной копии в своем естественном хозяине, при транспозиции в E. coli , 20% продуктов вставки являются коинтегратами, что указывает на возможность TnsB создавать шпильки на концах ДНК транспозона ⁴⁴ . Во-вторых, набор генов системы V-K (TnsB, TnsC и TniQ) аналогичен набору генов Tn5053, который содержит TniA, TniB (гомологи TnsB и TnsC) и TniQ ⁴⁴. Можно предположить, что резольваза, не кодируемая в локусе транспозона V-K, но все еще присутствующая в естественном хозяине, может иметь ту же активность, что и резольваза TniR. Дальнейшие исследования необходимо провести в S. hofmanni (или другие родственные цианобактерии), прежде чем мы сможем полностью понять РНК-управляемую транспозицию на типе V-K. Решение этих вопросов является ключевой предпосылкой для успешного создания новых комплексов CAST, способных интегрировать большие ДНК-грузы в геномы эукариот.

Наша структура обеспечивает механистическое понимание того, как CAST shTnsB распознает последовательности ДНК в RE и LE на левом и правом концах транспозона в STC. Структура также показывает конформационную гимнастику белка shTnsB для сборки с ДНК и дает подробное представление об активном кармане после катализа. Полное выяснение механизмов сборки shTnsB с остальными компонентами CAST потребуется, чтобы использовать системы CAST для РНК-управляемой геномной инженерии.

Вклад автора

GM задумал исследование, FTC и GM разработали биохимические эксперименты. FTC и SS установили протокол экспрессии и очистки. FTC и AF охарактеризовали свойства связывания белок-ДНК. FTC и LS создали мутантов и провели эксперименты по транспозиции. FTC и BLM выполнили анализ SEC-MALS, FTC подготовила сетки ЭМ и собрала крио-ЭМ изображения с помощью НС. FTC и NS выполнили крио-ЭМ обработку данных, построили модели, а GM с их помощью приступила к крио-ЭМ карте и структурному анализу. Общие результаты обсуждались и оценивались со всеми авторами. GM координировал и руководил проектом и написал рукопись при участии всех авторов.

Декларация об интересах

Гильермо Монтойя и Стефано Стелла являются соучредителями Twelve Bio. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Методы

Получение и очистка белков

Кодирующую последовательность (IDT) Scytonema hofmannii (UTEX 2349) tnsB (IDT) клонировали с помощью C- концевого вектора pETup2-tagistid1- Стол). Белки экспрессировали в клетках E. coli BL21 pRARE. Культуры E. coli выращивали при 37 °C в среде Terrific Broth (TB) с 100 мг/л ампициллина до OD ₆₀₀ 0,6. Сверхэкспрессию белков индуцировали 250 мМ IPTG в течение 16–18 ч при 18 °С. Клетки собирали центрифугированием, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Затем осадки ресуспендировали в лизирующем буфере (50 мМ HEPES pH 7,5, 500 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂, 1 мМ TCEP, 1 таблетка коктейля полных ингибиторов без ЭДТА (Roche) на 50 мл, 50 ЕД/мл бензоназы, 2 мг на 50 мл лизоцима). Ресуспендированные осадки перемешивали в течение одного часа при 4°С. Лизис завершали обработкой ультразвуком, а лизат центрифугировали при 10000 g в течение 45 мин для разделения растворимой и нерастворимой фракций. Растворимую фракцию загружали в 5 мл колонку HisTrap FF Crude (Cytiva), уравновешенную в буфере IMAC-A (50 мМ HEPES pH 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 10 мМ имидазол, 1 таблетка полного коктейля ингибиторов, не содержащего ЭДТА ( Roche) на 500 мл), а связанные белки элюировали ступенчатым увеличением концентрации имидазола буфером IMAC-B (50 мМ HEPES pH 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ TCEP, 500 мМ имидазол, 1 таблетка полного коктейля ингибиторов, не содержащего ЭДТА). (Рош) на 500 мл). Обогащенные белковые фракции объединяли и концентрацию NaCl снижали до 200 мМ с использованием буфера для разбавления (50 мМ HEPES, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Образец наносили на колонку HiTrap Heparin HP (GE Healthcare), уравновешенную буфером Heparin-A (50 мМ HEPES, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Белок элюировали линейным градиентом 0–100% буфера Heparin-B (50 мМ HEPES pH 7,5, 1 М NaCl, 1 мМ TCEP). Фракции, содержащие белок, объединяли и смешивали с TEV-протеазой для расщепления гистидиновой метки. Затем белок концентрировали и дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием колонки HiLoad 16/600 Superdex 200 (Cytiva), уравновешенной буфером SEC (50 мМ HEPES, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ TCEP). Фракции, содержащие чистый белок, объединяли, концентрировали до 9мг/мл, мгновенно замороженные в жидком азоте и хранящиеся при температуре -80 °C.

Анализ сдвига электромобильности (EMSA)

ДНК (донорскую, RE, LE или LTR(6)-SR(1)) смешивали с TnsB в буфере, содержащем 50 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ и 1 мМ TCEP. Концентрации ДНК и TnsB указаны на дополнительной фигуре 3c-e. Образцы инкубировали при 37°C в течение 30 мин и загружали в гели для замедления ДНК 6% (Thermo Fisher Scientific). ДНК выявляли окрашиванием геля GelRed (VWR). Затем тот же гель окрашивали InstantBlue (Life Technologies) для обнаружения присутствия TnsB и сравнения сдвигов полос.

Получение ДНК

Последовательности ДНК, соответствующие отдельным повторам, двойным повторам и одноцепочечной одноцепочечной ДНК, были приобретены у IDT. Молекулы ДНК, содержащие три или более повторов, были получены с помощью ПЦР с донорной ДНК, клонированной в pUC57 (Genewiz) в качестве матрицы (дополнительная таблица 1). Полную ДНК донора амплифицировали с использованием праймеров 5′-tgctacgtctctacgtgtacagtgactaat-3′ и 5′ ccacaaaaggcgtagtgtacagtgacaaat-3′, РЭ амплифицировали с использованием праймеров 5′-tgctacgtctctacgtgtacagtgactaat-3′ и 5′-atatacaaagcgacagtcaattgtcattatga5, ‘-attatattgatgacatttaatttgtcatcaattaattaag-3′ и 5′-ccacaaaaggcgtagtgtacagtgacaaat-3’. Амплифицированные последовательности очищали с использованием набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) и элюировали водой, не содержащей нуклеаз.

Крио-ЭМ пробоподготовка

Прекаталитический комплекс готовили с использованием 1 мкМ RE, 1 мкМ LE и 8 мкМ shTnsB в 300 мкл буфера, содержащего 50 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl. ₂ и 1 мМ TCEP. Образец инкубировали в течение 30 минут при 37°С и концентрировали до 50 мкл в фильтрах 10 кДа. STC был воссоздан следующим образом. LE и RE ssDNA смешивали по отдельности, инкубировали при 95°C в течение 5 минут и оставляли на льду на 10 минут. Впоследствии к RE и LE добавляли соответствующую целевую оцДНК. Оба образца инкубировали по отдельности при 70°С в течение 5 минут и оставляли на льду на 10 минут. Наконец, RE и LE смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Наконец, 50 мМ HEPES pH 7,5, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ и 1 мМ TCEP добавляли к 10 мкМ ДНК ДНК STC перед добавлением 40 мкМ TnsB. Образец инкубировали в течение 30 минут при 37°С.

Сетки для обоих образцов (прекаталитический комплекс и STC) были приготовлены путем нанесения 3 мкл свежеприготовленного STC (разведение 1:2) на сетки с отверстиями UltraAuFoil 300 меш R1,2/1,3 (Quantifoil), подвергнутые тлеющему разряду в течение 60 с при 10 мА (Leica EM ACE200) и заморозили погружением в жидкий этан (предварительно охлажденный жидким азотом) с использованием Vitrobot Mark IV (FEI, Thermo Fisher Scientific — время блоттинга 3 с, влажность 100%, 4 ° C).

Крио-ЭМ обработка данных

Обработка данных проводилась с помощью программы cryoSPARC версии 3.3.2 ²³ . Выполняли коррекцию движения заплаты и оценку CTF заплаты. 9 646 частиц K были первоначально отобраны из 4 574 микрофотографий с использованием устройства для сбора капель с минимальным и максимальным диаметром 50 и 200 Å соответственно, а затем извлечены и отсортированы с помощью двух раундов 2D-классификации. Выбранные 2D-классы содержали 415 тыс. частиц, извлеченных с использованием блока размером 416×416 пикселей. ab initio 3D-реконструкция использовалась в качестве начального объема для неравномерного уточнения, а полученные частицы были проанализированы с помощью анализа 3D-изменчивости ⁵¹ (дополнительная фигура 4), который выявил непрерывную конформационную изменчивость на дистальных концах ДНК. и близлежащие домены shTnsB (N-концевая часть и CTD цепей А и В). Два наиболее пространственно отличающихся объема были использованы в качестве эталонов для гетерогенного уточнения и дополнительно уточнены с помощью неоднородного (NU) уточнения до глобального разрешения 2,47 Å (269K частиц) и 2,81 Å (155 K частиц), на основе золотого стандарта корреляции оболочки Фурье (GSFSC) 0,143 критерия отсечки (дополнительная фигура 5). Параметры расфокусировки для каждой частицы и CTF для каждой группы были уточнены во время NU-уточнения. При визуальном осмотре плотность карты 2,47 Å оказалась значительно более непрерывной. Эта карта была дополнительно улучшена на дистальных концах с помощью еще одной итерации трехмерного анализа изменчивости частиц ⁵¹ и использования наиболее пространственно различных объемов в качестве эталонов для другого раунда гетерогенного уточнения. Большинство частиц попали в один класс (208 K), который был окончательно уточнен с помощью уточнения NU до карты 2,46 Å. Анализ 3DFSC показал сферичность 0,928 и диапазон углового разрешения 2,4–3,1 Å (дополнительный рисунок 5). Анализ локального разрешения был выполнен с помощью MonoRes ⁵² с использованием обертки cryoSPARC, который показал диапазон ~ 2–10 Å, большинство из которых составляло около 2,5 Å, а дистальная часть — 4–8 Å. Построение модели выполнялось на картах, подвергнутых постобработке с помощью DeepEMhancer ⁵³. В качестве входных данных использовались полукарты, в то время как нормализация и маскирование/шумоподавление входных объемов выполнялись автоматически в режиме tightTarget, что давало карты со значительно улучшенной интерпретируемостью.

Построение и уточнение атомной модели

Исходная модель была создана на основе структуры MuA (PDB:4fcy) с использованием сервера автоматизированного моделирования гомологии структуры белка SWISS-MODEL ⁵⁴ . Это был жесткий корпус, встроенный в карту с помощью ChimeraX ⁵⁵. Подгонка модели была проверена и дополнительно подобрана в COOT ⁵⁶, а менее упорядоченные N- и C-концевые области были удалены. Модель Alphafold ⁵⁷ мономера TnsB была впоследствии использована для включения некоторых из этих областей в карту. Модель была дополнительно перестроена de novo в COOT и уточнено с помощью phenix.real_space_refine ⁵⁸, а сервер гибкой настройки Namdinator молекулярной динамики использовался для ускорения и улучшения модели для сопоставления и для уточнения модели как на ранних, так и на поздних стадиях уточнение ⁵⁹ .

In vivo Анализ транспозиции и мутагенез

мутантов shTnsB (рис. 7) были созданы в векторе pHelper с использованием набора для клонирования In-Fusion от Takara и праймеров, содержащих желаемые точечные мутации. Транспозиционную активность CAST определяли с использованием векторов pHelper, pTarget и pDonor, полученных от Addgene (кат. № 1279).22, 127926 и 127924). Мутанты shTnsB (фиг. 7) были созданы в векторе pHelper с использованием набора для клонирования In-Fusion от Takara и праймеров, содержащих желаемые точечные мутации. Анализы in vivo проводили в соответствии с Saito et al. ⁶⁰ . Вкратце, по 12 нг pHelper, pTarget и pDonor трансформировали в 30 мкл TransforMax EC100 pir+ Electrocompetent E. coli (Lucigen). Клетки восстанавливали в течение 1 часа и высевали на среду LB, содержащую ампициллин, канамицин и хлорамфеникол. Клетки соскребали через 24 часа после посева, лизировали в 15 мкл буфера для лизиса колоний (TE с 0,1% Triton X-100), кипятили в течение 5 минут, разбавляли 30 мкл воды и центрифугировали при 4000 g в течение 10 минут для осаждения дебриса. Супернатант использовали для последующего анализа.

Анализ активности кПЦР

Частоту вставок относительно концентрации целевой плазмиды определяли с помощью кПЦР (TaqMan Fast Advanced Master Mix, Applied Biosytems) с набором праймеров/зонда (5′-6-FAM, Int ZEN и набор праймеров/зондов (5′-6-FAM, Int ZEN, 3′-Iowa Black, IDT), соответствующих продукту транспозиции (прямой праймер: 5′-ggttgagaagtcatttaataaggccactgttaaacg-3′, обратный праймер: 5′-aacgctgatgggtcacgacg- 3′, зонд: 5′-ctgtcgtcggtgacagattaatgtcattgtgac-3′) (рис. 7). Каждая реакция (11 мкл) содержала 2 мкл выделенных нуклеиновых кислот, 900 нМ прямого праймера, 900 нМ обратного праймера и 250 нМ зонда. Флуоресценцию измеряли с использованием прибора LightCycler 480 (Roche). Данные анализировали методом 2 ^-ΔΔCt, нормализующим с помощью pTarget Ct.

Дополнительные материалы

Дополнительные пояснения к рисункам

Дополнительный рисунок 1.- Выравнивание последовательностей представителей семейства транспозаз DDE . Аминокислотные последовательности EcTnsB, shTnsB, MuA и Tn5053 выравнивали с помощью Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). Рисунок был подготовлен с помощью ESPript (http://espript.ibcp.fr). Номера остатков помечены в соответствии с последовательностью shTnsB. Подобные остатки показаны красным цветом, а идентичные остатки — белым на красном фоне. Различные структурные домены shTnsB и их аминокислотный состав изображены в виде прямоугольников над последовательностями и помечены теми же именами и цветовым кодом, что и на рис. 1а. Мутации, выполненные в ключевых остатках, прокомментированных в тексте, отмечены звездочкой.

Дополнительный рисунок 2.- Очистка и характеристика shTnsB и комплекса переноса цепи. a) SDS-PAGE, показывающий очищенный shTnsB b) SEC-MALS очищенного TnsB (зеленый), ДНК STC (оранжевый) и TnsB:STC (фиолетовый). Результаты согласуются с теоретической молекулярной массой мономера TnsB (68 кДа) и отдельной связанной с мишенью ДНК RE и LE (52,6 кДа и 52 кДа). Что касается комплекса, то наблюдаемая молекулярная масса (358,7 кДа) соответствует комплексу, содержащему целевые связанные RE и LE и тетрамер TnsB, который имеет теоретическую молекулярную массу 376,6 кДа. c) Комплексы, содержащие донорскую ДНК с двумя разными грузами. Концентрация донорной ДНК во всех образцах составляла 100 нМ. Концентрация TnsB в каждом образце указана на рисунке. d) Комплексы, содержащие только RE или LE. Концентрация донорной ДНК во всех образцах составляла 300 нМ. Концентрация TnsB в каждом образце указана на рисунке. e) Комплекс, содержащий только LTR(6) и SR(1), протестирован при различных температурах и концентрациях NaCl. Концентрация ДНК составляла 2 мкМ, а концентрация TnsB — 4 мкМ.

Дополнительный рисунок 3.- Реконструкция с низким разрешением shTnsB, связанного с RE/LE в прекаталитическом состоянии. а) Типичная микрофотография этого комплекса белок-ДНК. b) 2D-классы, демонстрирующие изогнутую молекулу ДНК, связанную с двумя протомерами shTnsB. c) 3D-реконструкция на основе выбранных 2D-классов. Два протомера shTnsB были подобраны по плотности на основе структуры STC и по схеме, аналогичной прекаталитической структуре ecTnsB 9.0248 19 . NTD1 и NTD2 показаны пунктирными кружками, указывающими, где будет LTR.

Дополнительный рисунок 4.- Крио-ЭМ анализ одной частицы TnsB-STC. (a) Репрезентативные крио-ЭМ микрофотографии TnsB-STC в стекловидном льду на сетке UltraAuFoil 1,2/1,3 при расфокусировке -1,7 мкм. (b) Среднее значение класса 2D без ссылок, выбранное для реконструкции ab inito . (c) Обзор рабочего процесса обработки крио-ЭМ данных, выполненного в cryoSPARC.

Дополнительный рисунок 5.- Оценка разрешения и проверка карты TnsB-STC Cryo-EM (a) Карты локального разрешения в двух ориентациях, связанных поворотом на 90° вокруг оси Y. На вставке показано высокое разрешение, полученное на центральном срезе карты, плоскость отсечения указана выше. (b) Кривая корреляции оболочки Фурье золотого стандарта (GSFSC) после автозатягивания FSC-ask. (c) График распределения ориентации (вверху) и график распределения направления заднего положения (внизу). (d) Гистограмма и направленный график FSC. Гистограмма (синяя) показывает процент FSC на угол при заданной пространственной частоте. Глобальный FSC (красный) и ± 1 SD. от среднего направления FSC (зеленый). Сферичность равна 0,928 из 1. (e) Карта углового разрешения и соответствующий направленный объем FSC (серый) в трех перпендикулярных ориентациях. Относительное угловое разрешение указывается цветной полосой.

Дополнительный рисунок 6.- Взаимодействие белок-нуклеиновые кислоты в комплексе shTnsB-STC. Указаны полярные и неполярные контакты нуклеиновых кислот с боковой и основной цепью белка (см. условные обозначения).

Дополнительный рисунок 7.- Подгонка атомной модели ШТнсБ-СТЦ к крио-ЭМ карте. Области карты отображаются в диапазоне 2 Å в пределах отображаемых белковых остатков и нуклеотидов, на уровне контура 0,04 для панелей только белков и на уровне 0,1 для панелей белков/ДНК. Ключевые остатки и нуклеотиды помечены. (а) OD α2, остатки 504-520. (б) OD α1, остатки 484-499. (c) Стекирование взаимодействия между W178 из области петли NTD2-DDM и dT16 из верхней части нити LE_polyA. (d) Взаимодействие β-цепей, остатки 32-36 и 464-468 двух соседних цепей, соединяющих N-конец с MD-доменом соответствующих цепей. (e) Каталитический карман ДДЭ и ДНК, включая предполагаемую молекулу воды. (f) Полярные взаимодействия R99 и R106 из линкерной области NTD1-NTD2 с ДНК. (ж) Полярные взаимодействия доменов NTD1 R77 и R81 с ДНК.

Дополнительные легенды видео

Дополнительное видео 1.- Конформационная изменчивость комплекса shTnsB-STC. Трехмерный анализ изменчивости структуры с использованием cryoSPARC показывает, что сердцевина комплекса белок-ДНК достаточно стабильна, в то время как плечи Х-образной ДНК очень гибки.

Дополнительные таблицы

Дополнительная таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании.

Нуклеотиды, выделенные жирным шрифтом в ДНК, использованной для воссоздания комплекса shTnsB-STC для крио-ЭМ, обозначают последовательности, визуализированные в структуре (см. также рис. 6 приложения)

Дополнительная таблица 2. Крио-ЭМ обработка и уточнение модели

Благодарности

Мы благодарим Датский национальный центр крио-ЭМ в CFIM Копенгагенского университета и особенно Тиллманн Пейп за поддержку во время сбора крио-ЭМ данных. Мы также благодарим отдел экспрессии белков CPR за помощь в экспрессии и очистке белков. ФЖТЦ. является участником Копенгагенской программы докторантуры по биологическим наукам. Г.М. является частью Центра белковых исследований (CPR) Фонда Ново Нордиск, который финансируется Фондом Ново Нордиск (грант NNF14CC0001). Эта работа также была поддержана грантом NNF0024386, грантом NNF17SA0030214 и грантом Distinguished Investigator (NNF18OC0055061) для GM, который является членом Кластера интегративной структурной биологии (ISBUC) в Копенгагенском университете.

Литература

↵
Макарова К.С. и др. Эволюционная классификация систем CRISPR-Cas: взрыв класса 2 и производные варианты. Nat Rev Microbiol 18, 67–83, doi: 10.1038/s41579-019-0299-x (2020).
↵
Дудна, Дж. А. Перспективы и проблемы терапевтического редактирования генома. Nature 578, 229–236, doi: 10.1038/s41586-020-1978-5 (2020).
↵
Фор, Г. и др. CRISPR-Cas в мобильных генетических элементах: контрзащита и не только. Nat Rev Microbiol 17, 513–525, doi: 10.1038/s41579-019-0204-7 (2019).
↵
Петерс Дж. Э., Макарова К. С., Шмаков С., Кунин Е. В. Рекрутирование систем CRISPR-Cas Tn7-подобными транспозонами. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 114, E7358–E7366 (2017).
↵
Сид, К. Д. и др. Доказательства доминирующей линии специфических литических бактериофагов Vibrio cholerae, выделяемых больными холерой в течение 10-летнего периода в Дакке, Бангладеш. mBio 2, e00334–00310, doi: 10.1128/mBio.00334-10 (2011).
↵
Кунин Е.В., Макарова К.С. Происхождение и эволюция систем CRISPR-Cas. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 374, 20180087, doi: 10.1098/rstb.2018.0087 (2019).
↵
Рыбарски Дж. Р., Ху К., Хилл А. М., Уилке С. О. и Финкельштейн И. Дж. Метагеномное открытие CRISPR-ассоциированных транспозонов. Proc Natl Acad Sci U S A 118, doi:10.1073/pnas.2112279118 (2021).
↵
Шмаков С. и др. Разнообразие и эволюция систем CRISPR-Cas класса 2. Nature Reviews Microbiology 15, 169–182 (2017).
↵
Klompe, S.E., Vo, PLH, Halpin-Healy, T.S. & Sternberg, S.H. Системы CRISPR-Cas, кодируемые транспозонами, обеспечивают прямую интеграцию ДНК под управлением РНК. Природа 21 (2019).
↵
Hickman, A.B. et al. Неожиданное структурное разнообразие в рекомбинации ДНК: соединение эндонуклеазы рестрикции. Molecular Cell 5, 1025–1034 (2000).
Чой, К.Ю., Ли, Ю., Сарновский, Р. и Крейг, Н.Л. Прямое взаимодействие между субъединицами TnsA и TnsB контролирует гетеромерную транспозазу Tn7. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 110 (2013).
↵
Stellwagen, A.E. & Craig, N.L. Анализ мутантов с усилением функции АТФ-зависимого регулятора транспозиции Tn7. Журнал молекулярной биологии 305, 633–642 (2001).
↵
Сарновский Р. Дж., Мэй Э. У. и Крейг Н. Л. Транспозаза Tn7 представляет собой гетеромерный комплекс, в котором активность разрыва и соединения ДНК распределяется между различными генными продуктами. Журнал EMBO 15, 6348–6361 (1996).
↵
Peters, J. E. Tn7. Microbiology Spectrum 1, 1–20 (2014).
↵
Кудувалли, П. Н., Рао, Дж. Э. и Крейг, Н. Л. Структура ДНК-мишени играет решающую роль в транспозиции Tn7. EMBO Journal 20, 924–932 (2001).
↵
Райс, П. А., Крейг, Н. Л. и Дайда, Ф. Комментарий к «РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Science 368, doi:10.1126/science.abb2022 (2020).
↵
Стрекер, Дж., Ладха, А., Макарова, К.С., Кунин, Е.В. и Чжан, Ф. Ответ на комментарий к «РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Наука 368, doi:10.1126/science.abb2920 (2020).
↵
Холдер, Дж. В. и Крейг, Н. Л. Архитектура посттранспозиционного комплекса Tn7: сложная нуклеопротеиновая структура. Журнал молекулярной биологии 401, 167–181 (2010).
↵
Kaczmarska, Z. et al. Структурная основа распознавания концов транспозонов объясняет центральные особенности систем транспозиции Tn7. Mol Cell , doi:10.1016/j.molcel.2022.05.005 (2022).
↵
Дэвис Д. Р., Горышин И. Ю., Резникофф В. С., Реймент И. Трехмерная структура промежуточного соединения транспозиции синаптического комплекса Tn5. Science 289, 77–85, doi:10.1126/science.289.5476.77 (2000).
↵
Strecker, J. et al. Вставка ДНК под управлением РНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами. Наука 364, 48–53 (2019).
↵
Montaño, S.P., Pigli, Y. Z. & Rice, P.A. Структура транспозосом μ проливает свет на эволюцию рекомбиназы DDE. Nature 491, 413–417, doi:10.1038/nature11602 (2012).
↵
Пуджани, А., Рубинштейн, Дж. Л., Флит, Д. Дж. и Брубейкер, М. А. cryoSPARC: алгоритмы для быстрого неконтролируемого определения структуры крио-ЭМ. Nat Methods 14, 290–296, doi:10.1038/nmeth.4169 (2017).
↵
Юань, Ю. В. и Весслер, С. Р. Каталитический домен всех надсемейств эукариотических транспозаз вырезания и вставки. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7884–7889, doi:10.1073/pnas.1104208108 (2011).
↵
Allingham, J. S., Pribil, P. A. & Haniford, D. B. Все три остатка каталитической триады транспозазы Tn 10 DDE функционируют при связывании ионов двухвалентных металлов. J Mol Biol 289, 1195–1206, doi:10.1006/jmbi.1999.2837 (1999).
↵
Peterson, G. & Reznikoff, W. Мутации активного сайта транспозазы Tn5 указывают на положение донорской основной ДНК в синаптическом комплексе. J Biol Chem 278, 1904–1909, doi:10.1074/jbc.M208968200 (2003).
↵
Холм, Л. и Лааксо, Л. М. Обновление сервера Дали. Nucleic Acids Res 44, W351–355, doi:10.1093/nar/gkw357 (2016).
↵
Xu, H. E. et al. Кристаллическая структура комплекса парный домен Pax6 человека и ДНК показывает специфическую роль линкерной области и карбоксиконцевого субдомена в связывании ДНК. Genes Dev 13, 1263–1275, doi:10.1101/gad.13.10.1263 (1999).
↵
Benler, S. et al. Гены-карго Tn7-подобных транспозонов составляют огромное разнообразие защитных систем, мобильных генетических элементов и генов устойчивости к антибиотикам. mBio 12, e02

↵
Молина, Р. и др. Структура комплекса Csx1-cOA4 раскрывает основу распада РНК в CRISPR-Cas типа III-B. Nat Commun 10, 4302, doi: 10.1038/s41467-019-12244-z (2019).
Sofos, N. et al. Структуры комплекса Cmr-β) раскрывают регуляцию механизма иммунитета CRISPR-Cas типа III-B. Mol Cell , doi:10.1016/j.molcel.2020.07.008 (2020).
Стелла С., Алкон П. и Монтойя Г. Структура комплекса R-петли эндонуклеазы Cpf1 после расщепления ДНК-мишени. Nature 546, 559–563, doi:10.1038/nature22398 (2017).
↵
Stella, S. et al. Конформационная активация способствует катализу CRISPR-Cas12a и сбросу эндонуклеазной активности. Cell 175, 1856–1871 e1821, doi: 10.1016/j.cell.2018.10.045 (2018).
↵
Querques, I., Schmitz, M., Oberli, S., Chanez, C. & Jinek, M. Выбор и ремоделирование целевого сайта с помощью систем CRISPR-транспозонов типа V. Nature 599, 497–502, doi:10.1038/s41586-021-04030-z (2021).
Xiao, R. et al. Структурные основы распознавания ДНК-мишени с помощью CRISPR-Cas12k для РНК-управляемой транспозиции ДНК. Мол Ячейка 81, 4457–4466.e4455, doi:10.1016/j.molcel.2021.07.043 (2021).
↵
Shen, Y. et al. Структурная основа нацеливания ДНК транспозоном Tn7. Nat Struct Mol Biol 29, 143–151, doi: 10.1038/s41594-022-00724-8 (2022).
↵
Халпин-Хили, Т.С., Кломпе, С.Е., Штернберг, С.Х. и Фернандес, И.С. Структурная основа нацеливания ДНК с помощью системы CRISPR-Cas, кодируемой транспозонами. Природа 577, 271–274 (2020).
↵
Цзя, Н., Се, В., де ла Круз, М. Дж., Энг, Э. Т. и Патель, Д. Дж. Структурно-функциональное понимание начального этапа интеграции ДНК с помощью комплекса CRISPR-Cas-Транспозон. Cell Research 30, 182–184 (2020).
↵
Холдер, Дж. В. и Крейг, Н. Л. Архитектура посттранспозиционного комплекса Tn7: сложная нуклеопротеиновая структура. J Mol Biol 401, 167–181, doi:10.1016/j.jmb.2010.06.003 (2010).
↵
Скелдинг З., Куин-Бейкер Дж. и Крейг Н.Л. Альтернативные взаимодействия между транспозазой Tn7 и белком, связывающим ДНК-мишень Tn7, регулируют иммунитет и транспозицию мишени. Embo j 22, 5904–5917, doi:10.1093/emboj/cdg551 (2003).
↵
Макото, С. и др. Двойной режим CRISPR-ассоциированного самонаведения транспозонов. Cell 184, 1–13 (2021).
↵
Чой, К.Ю., Спенсер, Дж.М. и Крейг, Н.Л. Регулятор транспозиции Tn7 TnsC взаимодействует с субъединицей транспозазы TnsB и селектором мишени TnsD. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 111, 2858–2865 (2014).
↵
Райс, П. А., Крейг, Н. Л. и Дайда, Ф. Комментарий к «РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Наука doi:10.1126/science. abb2022 (2020).
↵
Стрекер, Дж., Ладха, А., Макарова, К.С., Кунин, Е.В. и Чжан, Ф. Ответ на комментарий к «РНК-управляемая вставка ДНК с CRISPR-ассоциированными транспозазами». Science doi:10.1126/science.abb2920 (2020).
↵
Холодий Г.Ю. и др. Четыре гена, два конца и res-область участвуют в транспозиции Tn5053: парадигма для нового семейства транспозонов, несущих либо мероперон, либо интегрон. Молекулярная микробиология 17, 1189 (1995).
Николас Э. и др. Семейство репликативных транспозонов Tn3. Microbiology Spectrum 3, MDNA3-0060-2014 (2014).
↵
Siguier, P., Gourbeyre, E. & Chandler, M. Известные известные, известные неизвестные и неизвестные неизвестные в прокариотической транспозиции. Текущее мнение по микробиологии 38, 171–180 (2017).
↵
Петровский С. и Станисич В. А. Tn502 и Tn512 являются охотниками за res-сайтами, что свидетельствует о независимой от резольвазы транспозиции в случайные сайты. Журнал бактериологии 192, 1865–1874 (2010).
↵
Минахина С., Холодий Г., Миндлин С., Юрьева О., Никифоров В. Транспозоны семейства Tn5053 являются охотниками за рез-сайтами, распознающими рез-сайты плазмид, занятые родственными резольвазами. Молекулярная микробиология 33, 1059 (1999).
↵
Chen, Q. et al. Структурная основа бесшовного вырезания и специфического нацеливания транспозазой piggyBac. Nature Communications 11, 3446 (2020).
↵
Пенджани, А. и Флит, Д. Дж. Трехмерный анализ изменчивости: устранение непрерывной гибкости и дискретной неоднородности в крио-ЭМ одиночных частиц. J Struct Biol 213, 107702, doi:10.1016/j.jsb.2021.107702 (2021).
↵
Vilas, J. L. et al. MonoRes: автоматическая и точная оценка локального разрешения для карт электронной микроскопии. Структура 26, 337–344.e334, doi:10.1016/j.str.2017.12.018 (2018).
↵
Sanchez-Garcia, R. et al. DeepEMhancer: решение для глубокого обучения для крио-ЭМ объемной постобработки. Биология коммуникации 4, 874, doi: 10.1038/s42003-021-02399-1 (2021).
↵
Bienert, S. et al. Репозиторий SWISS-MODEL — новые возможности и функциональность. Nucleic Acids Res 45, D313–d319, doi:10.1093/nar/gkw1132 (2017).
↵
Goddard, T.D. et al. UCSF ChimeraX: решение современных задач визуализации и анализа. Protein Sci 27, 14–25, doi:10.1002/pro.3235 (2018).
↵
Эмсли П., Локамп Б., Скотт В. Г. и Коутан К. Особенности и развитие Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486–501, doi:10.1107/s047493 (2010).
↵
Baek, M. et al. Точное предсказание белковых структур и взаимодействий с использованием трехдорожечной нейронной сети. Science 373, 871–876, doi:doi:10.1126/science.abj8754 (2021).
↵
Adams, P.D. et al. PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярной структуры. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213–221, doi:10.1107/s049025 (2010).
↵
Kidmose, R. T. et al. Namdinator — автоматическая молекулярно-динамическая гибкая подгонка структурных моделей к крио-ЭМ и кристаллографическим экспериментальным картам. IUCrJ 6, 526–531, doi:10.1107/s20522525119(2019).
↵
Saito, M. et al. Двойной режим CRISPR-ассоциированного самонаведения транспозонов. Cell 184, 2441–2453.e2418, doi:10.1016/j.cell.2021.03.006 (2021).

Наверх

Кибербезопасность, новости технологий и поддержка

BleepingComputer | Кибербезопасность, новости технологий и поддержка
Безопасность
Спонсорский контент
Wazuh — бесплатная платформа XDR с открытым исходным кодом
Wazuh — это бесплатная платформа безопасности с открытым исходным кодом, которая обеспечивает унифицированную защиту SIEM и XDR. Он защищает рабочие нагрузки в локальных, виртуализированных, контейнерных и облачных средах. Wazuh — одно из самых быстрорастущих решений для обеспечения безопасности с открытым исходным кодом, которое загружают более 10 миллионов раз в год.
При поддержке Wazuh
28 сентября 2022 г.
10:06
Apple
Россия требует ответов после того, как Apple удалила приложения ВКонтакте из App Store
Роскомнадзор сегодня потребовал от Apple объяснений по поводу удаления всех приложений ВКонтакте, в том числе приложения крупнейшей в стране социальной сети «ВКонтакте», из App Store в понедельник.
Сергей Гатлан
28 сентября 2022 г.
09:40
Безопасность
Криптомайнеры захватили системные ресурсы на сумму 53 доллара, чтобы заработать 1 доллар
По оценкам исследователей безопасности, финансовые последствия заражения криптомайнерами облачных серверов обходятся жертвам примерно в 53 доллара за каждый доллар, начисляемый злоумышленниками, добывающими криптовалюту на угнанных устройствах.
Билл Тулас
28 сентября 2022 г.
09:00
Предложения
Оцените этот отремонтированный iPad Mini 4 всего за 234,99 долларов США до 30 сентября
Выбрав этот Apple iPad Mini 4, вы сэкономите сотни долларов по сравнению с покупкой совершенно нового, что делает его отличной возможностью для людей, у которых есть финансовые проблемы — что, в наши дни, практически все мы.
BleepingComputer Deals
28 сентября 2022 г.
07:27
Безопасность
Утечка сборщика LockBit 3.0, используемого бандой вымогателей «Bl00dy» в атаках
Относительно новая банда вымогателей Bl00Dy начала использовать недавно просочившийся сборщик программ-вымогателей LockBit в атаках на компании.
Лоуренс Абрамс
28 сентября 2022 г.
03:30
Безопасность
Новый дроппер NullMixer заражает ваш компьютер десятком семейств вредоносных программ
Новая вредоносная дроппер под названием NullMixer одновременно заражает устройства Windows дюжиной различных семейств вредоносных программ с помощью поддельных программных кряков, продвигаемых на вредоносных сайтах в результатах поиска Google.
Билл Тулас
27 сентября 2022 г.
17:08
Microsoft
Microsoft откажется от правил клиентского доступа Exchange Online через год
Корпорация Майкрософт сегодня объявила, что откажется от правил клиентского доступа (CAR) в Exchange Online в течение года, к сентябрю 2023 года.
Сергей Гатлан
27 сентября 2022 г.
15:11
Безопасность, CryptoCurrency
Хакеры Lazarus сбрасывают вредоносное ПО для macOS через предложения о работе Crypto.com -срочная цель кражи цифровых активов и криптовалюты.
Билл Тулас
27 сентября 2022 г.
14:55
Deals
Подготовьтесь к карьере в области кибербезопасности с этим учебным курсом CompTIA за 35 долларов
Каждый курс в пакете подготовки к экзамену Professional CompTIA 2023 стоит 200 долларов при покупке по отдельности, но сегодня вы можете пройти все восемь курсов всего за 34,99 доллара.
BleepingComputer Deals
27 сентября 2022 г.
14:11
Security
Meta демонтирует крупную российскую сеть, подделывающую западные новостные сайты
Meta заявляет, что удалила большую сеть учетных записей Facebook и Instagram, которые распространяли дезинформацию, опубликованную на более чем 60 веб-сайтах, которые подделывали несколько законных новостных сайтов по всей Европе.
Сергей Гатлан
27 сентября 2022 г.
10:44
Безопасность
Хакер Optus извиняется и предположительно удаляет все украденные данные
Хакер, который утверждал, что взломал Optus и украл данные 11 миллионов клиентов, отозвал свои требования о вымогательстве после того, как столкнулся с повышенным вниманием правоохранительных органов. Злоумышленник также извинился перед 10 200 человек, чьи личные данные уже просочились на хакерский форум.
Билл Тулас
27 сентября 2022 г.
10:20
Безопасность
Спонсорский контент
Атаки Pass-the-Hash и способы их предотвращения в доменах Windows
Хакеры часто начинают с учетной записи пользователя низкого уровня, а затем работают над получением дополнительных привилегий, которые позволят им захватить сеть. Одним из методов, который обычно используется для получения этих привилегий, является атака с передачей хеша. Вот пять шагов для предотвращения атаки с передачей хеша в домене Windows.
При поддержке Specops
27 сентября 2022 г.
10:05
Microsoft
Корпорация Майкрософт объявляет об аутентификации без пароля и системе единого входа для Виртуального рабочего стола Azure
На этой неделе корпорация Майкрософт объявила о том, что поддержка Аутентификации без пароля для Виртуального рабочего стола Azure доступна в общедоступной предварительной версии.
Сергей Гатлан
27 сентября 2022 г.
09:01
Майкрософт
Windows 11 22h3 заблокирована из-за синего экрана на некоторых системах Intel
Корпорация Майкрософт теперь блокирует предложение обновления Windows 11 22h3 на некоторых системах с аудиодрайверами Intel Smart Sound Technology (SST).
Сергей Гатлан
27 сентября 2022 г.
07:41
Deals
Погрузитесь в более чем 100 часов обучения Python за 40 долларов
Изучение Python может быть довольно простым под руководством экспертов. Это именно то, что вы найдете в пакете Premium Python Programming Mega Certification Bundle 2023 года, который в настоящее время доступен за 40 долларов.
BleepingComputer Deals
27 сентября 2022 г.
07:14
Безопасность
Новое вредоносное ПО для кражи паролей Erbium распространяется как взломы игр и читы
Новое вредоносное ПО Erbium для кражи информации распространяется как поддельные взломщики и читы для популярных видеоигр с целью кражи учетных данных жертв и криптовалютных кошельков.
Билл Тулас
26 сентября 2022 г.
15:54
Безопасность
Хакеры используют файлы PowerPoint для доставки вредоносного ПО по наведению мыши
Хакеры, предположительно работающие на Россию, начали использовать новый метод выполнения кода, основанный на движении мыши в презентациях Microsoft PowerPoint, для запуска вредоносного скрипта PowerShell.
Билл Тулас
26 сентября 2022 г.
14:40
Технологии, Игры, Microsoft
Бета-версия NVIDIA GeForce Experience устраняет проблемы с играми в Windows 11 22h3
NVIDIA признала проблемы с производительностью, влияющие на системы с графическими процессорами NVIDIA после установки обновления Windows 11 22h3.
Сергей Гатлан
26 сентября 2022 г.
13:29
Безопасность
Рекламное ПО в Google Play и Apple Store установлено 13 миллионов раз
Исследователи в области безопасности обнаружили 75 приложений в Google Play и еще десять в Apple App Store, занимающихся мошенничеством с рекламой. В совокупности они составляют 13 миллионов установок.
Билл Тулас
26 сентября 2022 г.
11:33
Безопасность
Украина предупреждает союзников о планах России по эскалации кибератак
Служба военной разведки Украины предупредила сегодня, что Россия планирует «массированные кибератаки», нацеленные на критическую инфраструктуру Украины и ее союзников.
Сергей Гатлан
26 сентября 2022 г.
11:10
Посмотреть ещё
Влияние ожирения на нейтрализацию действия варфарина витамином К
Список журналов
Клин Аппл Тромб Хемост
т.25; Январь-декабрь 2019 г.
PMC6714928
Clin Appl Thromb Hemost. 2019 январь-декабрь; 25: 1076029618824042.
Опубликовано онлайн 2019 январь 28. DOI: 10.1177/1076029618824042
, PHARMD, BCPS, ¹ ^{, PHARMD, BCPS, ² ^{, PHARMD, BCPS, ² ^{, PHARMD, BCPS, ² и, PHARMD. Информация об авторских правах и лицензии Отказ от ответственности}}}
Фитонадион (витамин К1, ВК) является жирорастворимым и может секвестрироваться жировой тканью, таким образом потенциально изменяя распределение препарата у пациентов с ожирением, нуждающихся в отмене варфарина. Это одноцентровое ретроспективное когортное исследование, направленное на определение последствий ожирения. (определяется как индекс массы тела [ИМТ] ≥ 30 кг/м ² ) при отмене варфарина после введение ВК взрослым пациентам. Первичный результат был полным или частичным отмена варфарина (определяемая как международное нормализованное отношение [МНО] ≤ 2,0) в течение 72 часов после администрации ВК. Из 688 идентифицированных пациентов 215 были включены в первичное МНО. анализ. Средние значения ИМТ для пациентов с ожирением (n = 84) и без ожирения (n = 131) составили 37,3 и 24,3. кг/м 90 248 2 90 249 ( 90 240 P 90 241 < 0,001), а среднее исходное МНО было 4,73 и 4,42 ( P = 0,534) соответственно. В течение 72 часов после администрирования ВКонтакте, 70% и 69% групп с ожирением и без ожирения, соответственно, достигли полного или частичного отмена варфарина ( P = 0,904). Определена множественная логистическая регрессия исходное МНО и одновременное введение свежезамороженной плазмы являются факторами, влияющими на отмена варфарина. Эти данные не предполагают, что ожирение в значительной степени связано с снижение вероятности отмены варфарина в течение 72 часов после введения ВК.
Ключевые слова: антикоагулянты, кровотечения, клиническая фармакология
Варфарин, одобренный в 1954 г. в США, является широко используемым пероральным антикоагулянтом для профилактика и лечение тромбоэмболических осложнений, связанных с венозной тромбоэмболией и мерцательная аритмия. ¹ Антикоагулянтный эффект варфарина можно устранить с помощью антидота, фитонадиона, или витамин К1 (ВК). ^2,3 Поскольку ВК является жирорастворимым, он легко распределяется по тканям. ⁴ Было высказано предположение, что VK может секвестрироваться жировой тканью, что способствует для снижения циркулирующего ВК у лиц с более высоким процентным содержанием жира в организме. ⁵ Чтобы поддержать эту теорию, Shea et al. продемонстрировали накопление VK в жировой ткани в более высокие концентрации, чем в других органах, которые, как известно, хранят этот витамин (например, в печени). авторы также указали, что у женщин существует обратная связь между процентным содержанием жира в организме и плазма ВК. При потенциальной секвестрации жировой тканью распределение и эффективность администрируемого ВКонтакте.
Определены различные факторы, влияющие на эффективность ВКонтакте в международных изменение нормализованного отношения (INR). Tsu et al. продемонстрировали дозу ВК, способ введения и исходное МНО. повлияла на реверсию, тогда как домашняя доза варфарина не повлияла. ⁶ Производители рекомендуют VK от 2,5 до 10 мг первоначально при антикоагулянтной индуцированной дефицит протромбина и от 25 до 50 мг в редких случаях. ^2,3 Текущие руководства поддерживают использование ВК для отмены действия варфарина у пациентов с МНО более 10 или серьезное или опасное для жизни кровотечение, но не рутинное использование ВК у тех, с МНО от 4,5 до 10 и отсутствием признаков кровотечения. ⁷ Более низкие дозы (2,5–5 мг) перорального ВК рекомендуются пациентам, у которых наблюдается реверсия критерии без признаков кровотечения, в то время как более высокие дозы (5-10 мг) внутривенного (в/в) ВК предпочтительнее при большом кровотечении. ^7,8 Дальнейший анализ, проведенный Tsu et al., показал, что внутривенные дозы более 2 мг не приводят к более выраженное снижение МНО через 12, 24 и 48 часов. ⁶ Более высокие дозы могут привести к длительному воздействию на коагуляцию, например к гиперкоррекции МНО и временная рефрактерность к варфарину, что может потребовать перехода к парентеральному антикоагулянты для предотвращения тромбоэмболии. ^2-4
Отмена варфарина при ВК может зависеть от ожирения в дополнение к способу введения, дозе и способу введения ВК. базовый МНО. Недавняя литература по оценке индекса массы тела (ИМТ) при лечении варфарином. кровотечения указывают на более высокий риск кровотечения у пациентов с ожирением. ⁹ Ожирение было независимым предиктором неэффективности антикоагуляции (определяемой как МНО ≥1,5) в исследовании по оценке концентрата протромбинового комплекса (ПКК) при лечении варфарином острое внутричерепное кровоизлияние. ¹⁰ Однако, в то время как другие реверсивные агенты, такие как свежезамороженная плазма (СЗП) и КПК, указанная дозировка по весу, ^11,12 текущие рекомендации и рекомендации производителя для VK просто предлагают общий диапазон дозирования. ^2,3,7,8 Литература, оценивающая влияние ожирения на вызванное ВК снижение МНО для варфарина реверса не хватает.
Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, влияет ли ожирение на реверсию варфарина. после администрации ВК. Если ожирение действительно связано с повышенной заболеваемостью неэффективности лечения варфарином после введения ВК, это может потребовать более высоких доз ВК в пациенты с ожирением. Вторичная цель заключалась в оценке влияния ожирения на состояние пациента. исходы, такие как снижение заболеваемости и продолжительности при отмене варфарина с помощью ВК.
Дизайн исследования и пациенты
Это был ретроспективный когортный анализ, одобренный институциональным наблюдательным советом в рамках 49Учебно-педагогическая больница на 5 коек. Пациентов идентифицировали путем запроса электронной почты. заказы на лекарства для ВКонтакте и подтвержденные ручной проверкой. Пациенты имели право на включение, если им было не менее 18 лет, вводили ВК любым путем для лечение варфарином и госпитализированные в период с 1 января 2014 г. по 31 декабря 2016 г. Пациенты исключались, если они были заключенными или подопечными государства и если не было документально исходное МНО, последующее МНО после введения ВК, рост или вес.
Исходы
Первичным исходом была полная или частичная отмена варфарина (определяется как МНО 2,0 или меньше) в течение 72 часов после введения ВК. В частности, полная отмена варфарина. было определено как МНО менее 1,5, тогда как частичная реверсия варфарина была определена как МНО между 1,5 и 2,0. ^6,13 Вторичные результаты включали частоту и продолжительность переходного периода антикоагулянтной терапии, последующие тромбоэмболические и геморрагические госпитальные события, продолжительность пребывания и госпитальная летальность. Бриджинг был определен как временное использование парентерального антикоагулянты во время прерывания терапии варфарином, как правило, когда МНО ниже терапевтический диапазон. ¹⁴ Тромбоэмболические осложнения, включая тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, инфаркт, артериальный тромбоз, ишемический инсульт и транзиторная ишемическая атака. Главный кровотечение определяли как геморрагическое событие, приведшее к снижению гемоглобина не менее 2 г/дл, переливание 2 или более единиц эритроцитарной массы, симптоматическое кровотечение в критической области или органе и/или смерть. ¹⁵ Незначительное кровотечение определялось как любое другое кровотечение, не идентифицированное как большое кровотечение.
Сбор данных
Все данные пациентов хранились в электронной таблице Microsoft Excel (Редмонд, Вашингтон). Для обеспечения гарантии качества лица, ответственные за сбор данных, прошли обучение использование базы данных и выборочные проверки. Собраны базовые демографические данные включали возраст, расу, пол, рост, вес, ИМТ и домашнюю дозу варфарина. Дополнительная информация полученные из медицинских карт пациентов, включали сопутствующие лекарственные взаимодействия с варфарином. (например, амиодарон, сульфаметоксазол-триметоприм, метронидазол, флуконазол), доза ВК и маршрут, исходный уровень и последующие МНО до 72 часов после введения ВК, геморрагический и/или тромботические явления и дополнительная терапия (например, СЗП и ПКК). Если у пациентов было несколько значения роста и веса, документально подтвержденные в течение периода исследования, данные, ближайшие к моменту первоначального администрирования ВКонтакте. Были изложены классификации ожирения. по данным Всемирной организации здравоохранения с ожирением, определяемым как ≥ 30 кг/м ² . ¹⁶
Чтобы дополнительно выделить влияние ВК на снижение МНО, данные были обработаны для цензуры МНО. и дополнительно исключить пациентов. В частности, те, кто получил многократные дозы ВК, получил смешанную дополнительную терапию (например, несопутствующую СЗП, ПКК или активированный фактор VII), или имевшие не поддающееся расчету исходное МНО, были исключены после цензурирования МНО. Однако, пациенты, получавшие сопутствующую СЗП, определяемую как получающие СЗП в течение 1 часа после начальную дозу ВК, включали в эту заранее определенную подгруппу. Первичный результат полная или частичная реверсия варфарина оценивалась в вышеупомянутой субпопуляции, называется «первичным анализом МНО». И наоборот, население до этой секунды процесс исключения и цензурирования был назван «клинической когортой», в которой все вторичные исходы оценивались.
Статистический анализ
Все статистические анализы были выполнены с помощью программного обеспечения SAS 9.4 (Cary, Северная Каролина). Непрерывные переменные для групп с ожирением и без ожирения сравнивались с использованием Стьюдента. t тест, тогда как категориальные переменные сравнивались с использованием χ ² , точный тест Фишера и тест Манна-Уитни U . Сравнение результаты в пределах подклассов ИМТ были проведены с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и χ ² тест. Из-за изменчивости времени сбора МНО анализ оценки максимального правдоподобия использовались с логистической регрессией для оценки факторов связаны с неудачей нейтрализации варфарином в популяции первичного анализа МНО. Почта Анализ чувствительности hoc был также выполнен для первичного исхода. В целом, двусторонний α уровень <0,05 считался статистически значимым.
Из 688 выявленных пациентов, у которых был электронный заказ на ВК в заданное время диапазон, 335 и 215 пациентов были включены в клиническую когорту и первичный анализ МНО, соответственно ().
Открыть в отдельном окне
Блок-схема популяции пациентов. FFP означает свежезамороженную плазму; ФVIIа, рекомбинантный человеческий фактор свертывания крови VIIa; МНО, международный нормализованный рацион; ПКК, концентрат протромбинового комплекса; ВК, фитонадион.
Первичный анализ МНО
Приведены исходные характеристики пациентов с первичным анализом МНО (N = 215). в . В этом населения пациенты с ожирением, как правило, были старше, чем пациенты без ожирения (66,9 [12,9] против 73,9 [12,9] лет, 90 240 P 90 241 < 0,001) и реже получают сопутствующую терапию. амиодарон (n = 6; 7% против n = 31; 24%, P = 0,002). Средний вес и ИМТ у пациентов с ожирением было 110,9 кг и 37,3 кг/м ² , тогда как у пациентов без ожирения пациенты были 71,5 кг и 24,3 кг/м ² соответственно ( P < 0,001 для обоих). Из 84 пациентов с ожирением 34 (40%), 28 (33%) и 22 (26%) были классифицируются как ожирение I, II и III степени соответственно. Из 131 пациента без ожирения 8 (6%) были отнесены к категории людей с недостаточным весом (ИМТ <18,5 кг/м ² ). ¹⁶ Среднее исходное МНО было одинаковым в группах с ожирением и без ожирения (4,73 [1,94] против 4,42 [1,40], P = 0,534). Большая часть населения находилась антикоагулянты при мерцательной аритмии. В группах с ожирением и без ожирения 18 (21,4%) и 20 (15,3%) пациентов получали сопутствующую СЗП соответственно ( Р = .247). Для тех, кто получил сопутствующую СЗП, при этом каждая единица СЗП, по оценкам, содержит около 200 мл, средняя доза СЗП с поправкой на вес была ниже у пациентов с ожирением. пациентов (6,01 [3,95] против 9,25 [5,09] мл/кг, P = 0,036).
Таблица 1.
Исходные характеристики для пациентов с первичным анализом МНО (N = 215). ^a
Характеристика Ожирение, n = 84 Отсутствие ожирения, n = 131 P Value
Age, years 66. 9 (12.9) 73.9 (12.9) <.001
Weight, kg 110.9 (25.3) 71.5 (14.1) <.001
BMI, kg/m ² 37.3 (7.1) 24.3 (3.6) <.001
Baseline INR 4.73 (1.94) 4.42 (1.40 ) .534
Female 40 (48) 55 (42) .373
White 73 (87) 109 (83) . 889
Atrial fibrillation 46 (55) 131 (63) .253
21 (25) 33 (25) . 13 (10)
No bleeding 51 (61) 85 (65)
Amiodarone 6 (7) 31 (24) .002
Concomitant FFP 18 (21) 20 (15) .247
Открыть в отдельном окне
Сокращения: ИМТ, индекс массы тела; СЗП, свежезамороженная плазма; индийские рупии, международный нормированное соотношение.
^a Выражено как среднее значение (SD) или n (%).
Показания к отмене варфарина изображаются и различаются по степени кровотечения и повышение МНО в дополнение к необходимости нормализации МНО для неотложной процедуры, например, ортопедическая хирургия. ⁷ Наиболее распространенными показаниями для отмены варфарина у пациентов с ожирением и без ожирения были: (1) повышенное МНО между 4,5 и 10 без признаков кровотечения или предполагаемой неотложной помощи процедура, требующая нормализации МНО (n = 26; 31% против n = 35, 27%) и (2) большое кровотечение с любым МНО (n = 21, 25% против n = 33, 25%). Распределение сигналов разворота было одинаково для обеих групп ( P = 0,412). Как показано на , пути администрирования ВКонтакте не значительно различаются между группами ( P = 0,107). Распределение дозы Вводимый ВК обеспечивается в дозах ВК, разделенных на низкие (≤ 1,25 мг), средние (2–5 мг) и высокие (≥ 10 мг). ⁶
Таблица 2.
Показания к отмене варфарина для пациентов с первичным анализом МНО (N = 215). ^a
9 Незначительное кровотечение; неотложная процедура
Показания Ожирение, n = 84 Без ожирения, n = 131 P Значение
Большое кровотечение 21 (25) 33 (25) .412
2 (2) 2 (2)
Небольшое кровотечение; нет срочной процедуры; МНО ≥ 4,5 5 (6) 7 (5)
Небольшое кровотечение; нет срочной процедуры; МНО < 4,5 5 (6) 4 (3)
Нет кровотечения; неотложная процедура 18 (21) 28 (21)
Нет кровотечения; нет срочной процедуры; МНО > 10 3 (4) 5 (4)
Нет кровотечения; нет срочной процедуры; INR 4,5-10 26 (31) 35 (27)
Нет кровотечения; нет срочной процедуры; INR < 4,5 4 (5) 17 (13)
Открыть в отдельном окне
Сокращение: МНО, международное нормализованное отношение.
^a Выражается как n (%).
Открыть в отдельном окне
Путь введения фитонадиона при первичном анализе МНО. МНО показывает международное нормализованное отношение.
Таблица 3.
Распределение дозы фитонадиона при различных путях Администрация. ^a
Тучные, n = 84 Без ожирения, n = 131 P Value
Oral, mg
≤ 1.25 4 (17) 1 (2) .083
2-5 19 (79) 43 (81)
≥ 10 1 (4) 9 (17)
Intravenous, mg
≤ 1. 25 1 (3) 0 (0) . 711
2-5 15 (50) 29 (60)
≥ 10 14 (47) 19 (40)
Subcutaneous, mg
≤ 1.25 1 (4) 2 (8) .555
2-5 7 (30) 4 (15)
≥ 10 15 (65) 20 (77)
Intramuscular, mg
≤ 1,25 1 (14) 1 (25) > 0,05 ^b
2-5 1 (14) 0 (0)
≥ 10 5 (71) 3 (75)
Open in a separate окно
^a Выражено как n (% внутри подгруппы).
^b P значение для сравнения внутримышечной дозы фитонадиона распределения не удалось аппроксимировать с помощью Mann-Whitney U тест из-за небольшого размера выборки.
Из 215 пациентов, включенных в первичный анализ результатов, 59 (70%) пациентов с ожирением достигнута полная или частичная реверсия варфарина (МНО ≤ 2,0) в течение 72 часов после ВК введения по сравнению с 91 пациентом без ожирения (69%; P = 0,904). Полный или частичная реверсия варфарина в течение 24 и 48 часов после введения ВК не достоверно различаются между 2 группами (24 часа: n = 41; 49% против n = 67; 51%, P = 0,738; 48 часов: n = 58; 69% против n = 86; 66%, Р = .605). Полная реверсия варфарина (МНО < 1,5) в течение 72 часов после ВК. введения составили 56% и 50% для групп с ожирением и без ожирения, соответственно. ( P = 0,424). При сравнении первичного исхода у пациентов в пределах каждого подкласс ожирения по сравнению с группой без ожирения, существенных различий обнаружено не было. (класс I: 23/34 [68%], класс II: 20/28 [71%], класс III: 16/22 [73%]; P = 0,976).
Результаты множественной логистической регрессии показаны на . Два статистически значимых предиктора неэффективности лечения варфарином (МНО > 2,0 в течение 72 часов). Пациенты с повышенное исходное МНО с большей вероятностью приводило к неэффективности лечения варфарином (шансы отношение [OR] 1,223; 95% доверительный интервал [ДИ], 1,097-1,363; Р < .001). В качестве альтернативы, пациенты, получавшие сопутствующую СЗП, имели гораздо более низкие шансы получить варфарин. реверсивная неудача по сравнению с теми, кто этого не делал (ОШ 0,68; 95% ДИ, 0,489–0,0944; P = 0,021). Дальнейший анализ показал, что ожирение и ИМТ не значимые предикторы неэффективности лечения варфарином (ОШ 0,736; 95% ДИ 0,374-1,449; P = 0,374 и ОШ 0,98; 95% ДИ, 0,94-1,02; Р = .340, соответственно). Внутривенное введение ВК по сравнению с подкожным (п/к) прием не оказывал статистически значимого влияния на отмену действия варфарина. отказ (ИЛИ 0,549; 95% ДИ, 0,227-1,325; P = 0,107).
Таблица 4.
Неудачная реверсия варфарина посредством множественной логистической регрессии.
Скорректированное отношение шансов 95% доверительный интервал P Value
Baseline INR 1.22 1.09-1.36 <.001
Age 0.99 0.96-1.01 .446
IV vs SQ route 0.54 0.22-1.32 . 107
Phytonadione dose 0.98 0.88-1.09 .753
Concomitant FFP 0.68 0.48-0.94 .021
Ожирение 0,73 0,37-1,44 .374
Открытый в A-ABIRE 9000.SAIPAIAIS. МНО, международное нормализованное отношение; IV, внутривенный; SQ, подкожно.
Завершен апостериорный анализ чувствительности субпопуляции первичного анализа МНО которые не получали сопутствующую СЗП. Следовательно, полный или частичный прием варфарина частота регресса в течение 72 часов после введения ВК не отличалась между тучными и пациенты без ожирения в этой конкретной подгруппе (44/66 [67%] против 73/111 [66%], P = 0,902].
Клинический когортный анализ
Исходные характеристики клинической когорты (N = 335) приведены в . Эти выводы были в целом сопоставимы с данными первичного анализа МНО, показывая статистически существенные различия между пациентами с ожирением и без ожирения в возрасте (67,5 [13,4] против 73,5 лет). [13.4], P < 0,001) и сопутствующий амиодарон (n = 15; 12% против n = 41; 20%, n = 0,043). Более половины клинической когорты получали СЗП по крайней мере один раз в течение при поступлении (с ожирением: n = 68; 52% по сравнению с отсутствием ожирения: n = 114; 56%; P = 0,554). Исходы для пациентов в стационаре описаны в . Антикоагулянты снижают заболеваемость и продолжительность существенно не отличалась между группами с ожирением и без ожирения (35% против 41%, P = 0,266 и 3,6 [2,7] против 4,3 [3,3] дня, P = 0,183, соответственно). В обеих группах SQ эноксапарин был наиболее часто используемым парентеральным препаратом. антикоагулянт для связывания (27/46 [59%] против 53/85 [62%], P = 0,681).
Таблица 5.
Исходные характеристики пациентов клинической когорты (N = 335). ^a
.
Характеристика Ожирение, n = 130 Отсутствие ожирения, n = 205 P Value
Age, years 67.5 (13.4) 73.5 (13.4) <.001
Weight, kg 109.0 (22.4) 71.7 (27.2) <.001
BMI, kg/m ² 36.7 (7.9) 24.5 (7.8) <. 001
Baseline INR ^b 5.01 (3.59) 5.03 (3.60) .961
Female 58 (45) 89 (43) .829
White 100 (77) 170 ( 83) .175
Мерцательная аритмия 73 (56) 121 (59) 22 (11)
No bleeding 68 (52) 119 (58)
Amiodarone 15 (12) 41 (20) . 043
FFP администрация 68 (52) 114 (56) .554
Открыть в отдельном окне
Сокращения: ИМТ, индекс массы тела; СЗП, свежезамороженная плазма; индийские рупии, международный нормированное соотношение.
^a Выражено как среднее значение (SD) или n (%).
^b Один пациент с ожирением и 2 пациента без ожирения с не поддающимся подсчету МНО были исключены из этого расчета.
Таблица 6.
Результаты лечения пациентов в клинической когорте (N = 335). ^а
Ожирение, n = 130 Отсутствие ожирения, n = 205 P Value
Bridging incidence 46 (35) 85 (41) . 266
Bridging duration, days 3.6 (2.7) 4.3 (3.3) .183
Новый тромб 2 (2) 8 (4) .326
Продолжительность пребывания, дни 8,1 (6,9) 7,97777777777750 .789
Внутренняя смертность 8 (6) 10 (5) . окно
^a Выражено как среднее значение (SD) или n (%).
Группа с ожирением в клинической когорте состояла из 65 (50%), 36 (28%) и 29 (22%) пациенты с ожирением I, II и III степени соответственно. Преодоление инцидентов и продолжительность у пациентов с ожирением I, II и III классов была аналогична таковой у пациентов без ожирения. группа ( Р = 0,476; P = 0,435 через ANOVA). Длина больницы пребывания для пациентов с ожирением I, II и III классов составили 7,6 (7,1), 7,3 (5,0) и 10,1 (8,1) дней соответственно ( P = 0,285 по сравнению с группой без ожирения через АНОВА).
Результаты показывают, что ожирение не может быть связано с повышенной вероятностью приема варфарина реверсивная недостаточность в течение 72 часов после введения ВК. Показатели отмены варфарина среди 3 подклассы ожирения также не различались. И наоборот, одновременное введение СЗП и исходное МНО были факторами, которые значительно повлияли на реверсию варфарина, т.е. соответствует ранее опубликованной литературе. ⁶ Анализ чувствительности, из которого были исключены пациенты, получавшие сопутствующую СЗП, дал результаты, аналогичные результатам первичного анализа INR.
Множественная логистическая регрессия показала, что внутривенное введение ВК имело тенденцию к меньшая вероятность неэффективности лечения варфарином по сравнению с однократным введением (OR 0,549), но это не было статистически значимым. Это может быть связано с заранее заданным, более длительное время наблюдения за МНО, составляющее 72 часа, поскольку повышенное МНО обычно со временем нормализуется, независимо от введения ВК, так как фармакологическая активность варфарина ослабевает, а печень продуцирует факторы свертывания крови, что в конечном итоге приводит к возможности отрицательного смешения. Ранее опубликованная литература поддерживает этот вывод, поскольку Ни и др. продемонстрировали внутривенную ВК, вызванную большее снижение МНО через 24 часа по сравнению с SQ VK, но оба пути привели к сходным результатам. Снижение МНО через 72 часа. ¹⁷
Что касается пути введения ВК, наше исследование показало широкое использование (23%) подкожного введения ВК в популяция для первичного анализа МНО. Тем не менее, пероральное и внутривенное введение ВК предпочтительнее п/к ВК из-за его неустойчивая абсорбция и влияние на реверсию варфарина. ^4,7 Этот результат может быть связан с условиями исследования, когда врачи-резиденты входят в большую доля заказов на лекарства. Кроме того, поставщик опасается повышенной чувствительности реакции, связанные с внутривенным введением ВК, могут частично способствовать неожиданному частое использование SQ VK для отмены варфарина. ² Исторически сложилось так, что частота анафилаксии, связанной с ВК, была очень низкой. заболеваемость 3 на 100 000 доз. ¹⁸ В наше исследование был включен 1 случай с подозрением на анафилаксию из 174 доз внутривенного введения ВК. ¹⁸ Теоретически, высокое использование SQ VK должно снизить скорость реверсии варфарина у пациентов с ожирением. пациентов по сравнению с пациентами без ожирения из-за увеличения объема жировой ткани для секвестрации жирорастворимых ВК у пациентов с ожирением, но это открытие не было подтверждено нашими результаты в подгруппе пациентов, получавших SQ VK (с ожирением: 17/23 [74%] по сравнению с отсутствием ожирения: 17/26). [65%], P = 0,517). Отдельная фармакокинетическая теория для объяснения этих незначительные результаты – секвестрация ВК жировой тканью может привести к пролонгированным эффектам ВК на коагуляцию, так как антидот со временем перераспределяется в организме, что позволяет постепенное снижение МНО и отмена варфарина в течение 72 часов. ⁴ Кроме того, у лиц с ожирением обычно выше распространенность стеатоза печени и неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), которая гипотетически может способствовать доставке вводят жирорастворимые ВК в печень, тем самым способствуя выработке фактора свертывания крови и увеличение вероятности отмены варфарина. ¹⁹ Из 130 пациентов с ожирением в клинической когорте у 4 (3%) были документально подтверждены хронические заболевания печени. заболевание, ни одно из которых не связано с НАЖБП. Все еще вероятно, что многие пациенты с ожирением имели некоторую степень стеатоза печени, что, следовательно, может повлиять на распределение ВК. Тем не менее, пути введения ВК существенно не отличались между людьми с ожирением и без него. группы и биологическую достоверность исходной теории секвестрации ВК жировой тканью. ткани должны быть без изменений. Кроме того, сравнение групп с ожирением и без ожирения, которые пероральные или внутривенные ВК не дали различий в первичных результатах (36/54 [67%] против 73/101 [72%], P = 0,466).
Множественная логистическая регрессия с помощью анализа оценок максимального правдоподобия не показала увеличение ИМТ ассоциировалось с увеличением вероятности неэффективности лечения варфарином. ( P = 0,340), так как она имела тенденцию к противоположному результату, хотя и с клинически незначительное снижение вероятности неудачного лечения варфарином (ОШ 0,98).
Как показано на рисунке, страдающие ожирением и госпитальные исходы у пациентов без ожирения не различались в отношении частоты промежуточного звена и продолжительность, частота новых тромбов, продолжительность пребывания в стационаре и смертность. Однако пациенты с ожирение III степени, иногда известное как «патологическое ожирение», по статистике незначительное увеличение средней продолжительности пребывания на 10,1 дня по сравнению с другими ИМТ категорий (средняя продолжительность пребывания от 7,3 до 7,9дней). Это может быть связано с большее количество и тяжесть сопутствующих заболеваний, связанных с ожирением III степени. ²⁰
Средняя доза СЗП с поправкой на вес для обеих групп была ниже рекомендуемого диапазона доз от 10 до 15 мл/кг, но недостаточная дозировка СЗП, по-видимому, является обычным явлением в клинической практике. ^11,21 В дополнение к отсутствию у поставщика знаний о дозировке СЗП, индивидуализированные цели поставщика реверсия варфарина может способствовать этой недостаточной дозировке, поскольку поставщики могут стремиться к разным Цели МНО (например, полная и немедленная нормализация МНО при больших кровотечениях по сравнению со снижением МНО). до 1,9или менее за 24 часа для плановых процедур при отсутствии кровотечения).
Хотя текущее исследование предоставляет дополнительные данные, касающиеся факторов, связанных с ВК реверс, есть ограничения. Во-первых, изменчивость индивидуализированных целей провайдера в часто наблюдается реверсия варфарина. Пациенты могут иметь различные показания для варфарина с ВК, а это неизбежно приводит к разным решениям по введение и дозирование ВК и СЗП. В действительности, несмотря на то, что они демонстрируют аналогичный распределение классифицированных автором показаний к отмене варфарина между пациентами с ожирением и без него групп в первичном анализе МНО, исследуемая популяция может быть гетерогенной, таким образом увеличивает вероятность путаницы и предвзятости. Частично это было объяснено через множественная логистическая регрессия. Кроме того, ретроспективный и наблюдательный характер это исследование увеличивает разнородность данных, поскольку оно не позволяет проводить унифицированный мониторинг МНО. частоты и тайминги после администрирования ВКонтакте. В зависимости от того, как часто и когда проводились лабораторные анализы МНО. нарисованные, показатели отмены варфарина в более короткие сроки, такие как те, которые оценивались в ранее опубликованная литература (например, 12 и 24 часа) может быть неопределенной, если лабораторные исследования МНО проводятся нечасто. ⁶ Следовательно, эти результаты в более короткие сроки не сообщались. Авторы также считается интерполяцией и экстраполяцией значений МНО на определенные моменты времени (например, 12, 24, и 48 часов) с использованием ранее существовавших значений МНО неуместно, поскольку нет доказательств того, что предполагают снижение МНО линейным или другим хорошо смоделированным образом после введения ВК в течение такие периоды времени. Признавая высокую вероятность возникновения проблем с синхронизацией МНО, авторы определили время последующего наблюдения МНО 72 часа для первичного исхода, хотя этот 72-часовой последующее наблюдение также дает больше времени для нормализации МНО, что потенциально влияет на первичный исход. Проспективный дизайн исследования с заранее установленным временем лабораторных отборов МНО может устранить это ограничение.
В клинической практике, если начальная доза ВК не обеспечивает адекватного снижения МНО в реверсия варфарина с дополнительной терапией, такой как СЗП, или без нее, поставщики могут повторить Применение ВК с теоретическим потенциалом последующей рефрактерности к варфарину с частое введение высоких доз ВК (≥ 10 мг). ^2-4,6 В результате это может быть связано с увеличением частоты и длительности мостовидного мостовидного протеза. ^4,6 В настоящее время практически нет опубликованных данных, адекватно подтверждающих индивидуальные дозы ВК, начальная или последующие, более 10 мг у пациентов, нуждающихся в реверсия варфарина (исключая отравление суперварфарином), независимо от степени ожирения. ^4,22
Ретроспективная наблюдательная оценка отмены варфарина в течение 72 часов после ВК введение в академическую клиническую больницу предполагает полное или частичное изменение МНО в течение 72 часов после введения ВК не влияет на статус ожирения. Кроме того, ИМТ как непрерывная переменная существенно не повлияла на этот результат. Хотя по весу существует дозировка СЗП и других методов лечения для купирования индуцированной варфарином коагулопатии, ^11,12 в клинической литературе практически нет доказательств в поддержку увеличения доз ВК исключительно на основе массы тела или ИМТ. Эти результаты подчеркивают необходимость дополнительных исследований в области Эффективность и безопасность антикоагулянтов у пациентов с экстремальной массой тела поскольку их фармакокинетические различия теоретически могут влиять на результаты.
Авторы хотели бы отметить вклад Техасского технологического университета здравоохранения Научный центр, Институт клинических исследований, а также Обри Баст и Шина Чокши, Кандидаты PharmD, которые помогали в сборе и анализе данных.
Примечание авторов: Этическое разрешение на проведение данного исследования получено от Техасского технологического университета. Институциональный наблюдательный совет Центра медицинских наук Амарилло (IRB # A17-3994). информированный согласие на публикацию информации о пациенте в этой статье не было получено, поскольку Проверка Институционального наблюдательного совета показала, что это исследование соответствует заранее определенным критериям, таким как как минимальный риск, и в соответствии с 45 CFR 45.116 (d) отменил требование документальное согласие. Эта работа была представлена в виде плаката (абст. № 44108) на Конференция Американского колледжа клинической фармации, Феникс, Аризона, 9 октября., 2017.
Декларация о конфликте интересов: Автор(ы) заявили об отсутствии потенциального конфликта интересов в отношении исследования, авторство и/или публикация этой статьи.
Финансирование: Автор(ы) не получали финансовой поддержки для исследования, авторства и/или публикации этой статьи.
ORCID iD: Stanley A. Luc, PharmD, BCPS https://orcid.org/0000-0002-1294-7985
1. Пирмохамед М. Варфарин: ему почти 60 лет, а он до сих пор вызывает проблемы. Бр Дж Клин Фармакол. 2006;62(5):509–511. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
2. Витамин K1 — инъекция фитонадиона, эмульсия [упаковка вставлять] Зейнсвилл, Огайо: Кардинальное здоровье; 2015. [Google Scholar]
3. Мефитон — фитонадион в таблетках [вкладыш в упаковку] Бриджуотер, Нью-Джерси: Valeant Pharmaceuticals ООО «Северная Америка»; 2013. [Google Scholar]
4. Дагер ВЭ. Разработка плана ведения пероральных антикоагулянтов разворот. Am J Health Syst Pharm. 2013;70(10 доп. 1):S21–S31. [PubMed] [Академия Google]
5. Ши М.К., Бут С.Л., Гундберг С.М. и др. Ожирение в зрелом возрасте положительно связано с ожирением концентрации витамина К в тканях и обратно пропорционально показателям циркуляции статуса витамина К у мужчин и женщин. Дж Нутр. 2010;140(5):1029–1034. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
6. Цу Л.В., Диенес Дж.Э., Дагер В.Е. Дозировка витамина К для реверсии варфарина в зависимости от МНО, способ введения введения и домашняя доза варфарина в неотложной / интенсивной терапии параметр. Энн Фармакотер. 2012;46(12):1617–1626. [PubMed] [Академия Google]
7. Холбрук А., Шульман С., Витт Д.М. и др. Доказательная тактика антикоагулянтной терапии: антитромботическая терапия и профилактика тромбозов, 9-е изд.: American College of Chest Рекомендации врачей по клинической практике, основанные на фактических данных. Грудь. 2012;141(доп. 2): e152S–e184S. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
8. Анселл Дж., Хирш Дж., Хайлек Э., Джейкобсон А., Кроутер М., Паларети Г. Фармакология и лечение антагонистами витамина К: Руководящие принципы клинической практики, основанные на фактических данных Американского колледжа врачей-пульмонологов (8-е место). версия). Грудь. 2008;133(доп. 6): 160S–198С. [PubMed] [Google Scholar]
9. Огунсуа А.А., Турей С., Луи Дж.К., Ип Т., Эскобар Дж.В., Гор Дж. Индекс массы тела предсказывает риск серьезных кровотечений у пациентов на варфарине. J Тромб Тромболизис. 2015;40(4):494–498. [PubMed] [Google Scholar]
10. Чу С, Токумару С, Изуми К, Накагава К. Ожирение увеличивает риск неэффективности антикоагулянтной терапии с концентратом протромбинового комплекса у пациентов с внутричерепным кровотечение. Int J Neurosci. 2016;126(1):62–66. [PubMed] [Академия Google]
11. Томаселли Г.Ф., Махаффи К.В., Кукер А. и др. Путь консенсуса экспертов ACC по управлению в 2017 г. кровотечений у пациентов, принимающих пероральные антикоагулянты: отчет Американского колледжа Целевая группа по кардиологии по путям принятия решений на основе консенсуса экспертов. Дж Ам Колл Кардиол. 2017;70(24):3042–3067. [PubMed] [Google Scholar]
12. Kcentra—протромбин, фактор свертывания крови VII человека, фактор свертывания крови IX Человек, фактор свертывания крови X человека, протеин C, протеин S, человеческий и вода [пакет вставлять] Канкаки, Иллинойс: ЦСЛ Беринг ГмбХ; 2014. [Google Академия]
13. Тран Х., Коллекут М., Уайтхед С., Салем Х.Х. Концентраты протромбинового комплекса, используемые отдельно при неотложных отмена антикоагулянтной терапии варфарином. Стажер J Med. 2011;41(4):337–343. [PubMed] [Google Scholar]
14. Douketis JD, Spyropoulos AC, Spencer FA, et al. Периоперационное ведение антитромботической терапии: антитромботическая терапия и профилактика тромбозов, 9-е изд.: American College of Chest Рекомендации врачей по клинической практике, основанные на фактических данных. Грудь. 2012;141(доп. 2): e326S–e350S. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
15. Каатц С., Ахмад Д., Спиропулос А.С., Шульман С.; Подкомитет по контролю за Антикоагуляция. Определение клинически значимого незначительного кровотечения в исследованиях антикоагулянтов при мерцательной аритмии и венозной тромбоэмболии заболевание у нехирургических пациентов: сообщение от SSC ИСТХ. Джей Тромб Хемост. 2015;13(11):2119–2126. [PubMed] [Google Scholar]
16. Всемирная организация здравоохранения. Ожирение: Предотвращение и управление глобальной эпидемией. Отчет о консультации ВОЗ. Технический Отчет серии 894. Женева, Швейцария: ВОЗ; 2000. [PubMed] [Google Scholar]
17. Ни Р., Доппеншмидт Д., Донован Д.Дж., Эндрюс Т.С. Внутривенное и подкожное введение витамина К1 при реверсировании чрезмерная пероральная антикоагулянтная терапия. Ам Джей Кардиол. 1999;83(2):286–288. [PubMed] [Google Scholar]
18. Ригерт-Джонсон Д.Л., Волчек Г.В. Частота анафилаксии после внутривенного введения фитонадион (витамин К1): 5-летний ретроспективный обзор. Анна Аллергия Астма Иммунол. 2002;89(4):400–406. [PubMed] [Академия Google]
19. Williams CD, Stengel J, Asike MI, et al. Распространенность неалкогольной жировой болезни печени и неалкогольный стеатогепатит среди населения в основном среднего возраста с использованием ультразвука и биопсия печени: проспективное исследование. Гастроэнтерология. 2011;140(1):124–131. [PubMed] [Google Scholar]
20. Китахара С.М., Флинт А.Дж., Беррингтон де Гонсалес А. и др. Ассоциация между ожирением III степени (ИМТ 40-59 кг/м ² ) и смертность: объединенный анализ 20 проспективных исследования. ПЛОС Мед. 2014;11(7):e1001673. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
21. Кровь и трансплантация Национальной службы здравоохранения Великобритании. Национальный Сравнительный аудит использования свежезамороженной плазмы: полный отчет. http://hospital.blood.co.uk/library/pdf/Audit_of_FFP_Elsewheres2009.pdf. Опубликовано в феврале 2009 г. По состоянию на 21 мая 2018 г.
22. Кинг Н., Тран М.Х. Антикоагулянтный родентицид длительного действия (суперварфарин) отравления: обзор истории его развития, эпидемиологии и клинической картины управление. Transfus Med Rev. 2013;29(4):250–258. [PubMed] [Google Scholar]
Статьи по клиническому и прикладному тромбозу/гемостазу предоставлены здесь с разрешения Публикации SAGE
Лиофилизация клеток млекопитающих с использованием трегалозы: сохранение целостности ДНК
Реферат
Целью данного исследования было изучение сохранения биомолекулярных структур, в частности ДНК, в лиофилизированных фибробластах после загрузки трегалозой посредством поглощения, индуцированного замораживанием. . Клетки лиофилизировали только с трегалозой или в смеси альбумина и трегалозы. Альбумин был добавлен для повышения температуры стеклования и стабильности при хранении. После сушки вымораживанием и регидратации жизнеспособные клетки не восстанавливались. Исследования FTIR показали, что поведение мембранной фазы лиофилизированных клеток напоминает поведение свежих клеток. Однако через сутки после регидратации наблюдалось разделение фаз мембраны независимо от присутствия или отсутствия трегалозы во время лиофилизации. Лиофилизация не влияла на общую вторичную структуру белка. Анализ повреждения ДНК с помощью гель-электрофореза отдельных клеток («кометный анализ») показал, что повреждение ДНК прогрессивно увеличивалось с увеличением продолжительности хранения и температуры. Повреждение ДНК было предотвращено при хранении при 4 °C. Показано, что трегалоза уменьшает повреждение ДНК при хранении, в то время как добавление альбумина, по-видимому, не оказывает дополнительного защитного действия на стабильность при хранении (т. е. целостность ДНК), несмотря на то, что альбумин увеличивает температуру стеклования. В совокупности ДНК в лиофилизированных соматических клетках можно сохранить, используя трегалозу в качестве защитного средства и храня при температуре 4 °C или ниже.
Введение
Лиофилизация является одним из наиболее широко используемых методов сухого консервирования биологических материалов ¹ . Сушка вымораживанием применялась для сохранения белков и липосом для фармацевтических целей с использованием сахаров в качестве основного защитного средства ^2,3,4 . Однако сублимационная сушка клеток проводится реже из-за трудностей с загрузкой клеток лиопротекторами. Клетки, которые по своей природе более устойчивы к стрессу, вызываемому высыханием, такие как бактерии ⁵ и дрожжи ⁶ синтезируют лиопротекторы при воздействии стресса и могут быть лиофилизированы, возобновляя метаболизм при регидратации. Клетки млекопитающих обычно не выдерживают высушивания, но биомолекулы часто хорошо сохраняются. Структура хроматина сперматозоидов, например, в лиофилизированных сперматозоидах практически не изменена, и их можно использовать для оплодотворения ооцита посредством интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов ⁷ . Лиофилизированные тромбоциты сохраняют способность к свертыванию и могут использоваться для местного заживления ран ^{8, 9} . Другие исследования показали потенциал лиофилизации для сохранения генетической информации соматических и стволовых клеток ^10,11,12 .
При сублимационной сушке образцы сначала замораживают, после чего лед удаляют сублимацией в вакууме. Во время фазы вторичной сушки остаточная влажность образца снижается до содержания воды около 0,05 г H ₂ O на г сухого веса или ниже. Весь процесс сублимационной сушки включает резкие изменения температуры образца, уровня гидратации и условий давления. И замораживание, и сушка являются серьезными факторами стресса, которые могут повредить биомолекулы и клеточные структуры ¹³ . Особенно удаление воды, окружающей биомолекулы, может привести к необратимым структурным изменениям фазового состояния и организации клеточных мембран и агрегации белков ¹⁴ . Кроме того, известно, что повышенный уровень активных форм кислорода (АФК) вызывает повреждения. Липиды в мембранах особенно чувствительны к атаке свободных радикалов ROS ¹⁵ . Несмотря на то, что после лиофилизации жизнеспособные клетки не восстанавливаются, хроматин часто хорошо сохраняется, и ядра лиофилизированных клеток могут быть перенесены в другие клетки ^{10, 16, 17} . Однако хроматин подвергается окислительной атаке во время хранения ^{18, 19} .
Сушка вымораживанием требует использования специальных защитных средств для стабилизации биомолекул как во время замораживания, так и во время сушки. Примеры включают невосстанавливающие дисахариды, такие как сахароза и трегалоза. Эти сахара обладают хорошими стеклообразующими свойствами ^{20, 21} и могут замещать водородные связи воды с биомолекулами при дегидратации ²² . Стекло представляет собой высоковязкое состояние, в котором залегают клеточные структуры с одновременным замедлением молекулярной подвижности и повреждающих реакций ^23,24,25 . Стекла, состоящие из отдельных соединений или смесей, имеют характерную температуру стеклования, ниже которой резко возрастает вязкость. Температура стеклования (T _g ) сахаров зависит от молекулярной массы сахара, а также от межмолекулярных взаимодействий. Как правило, Т _г сахаров увеличивается с увеличением молекулярной массы. Среди дисахаридов трегалоза имеет аномально высокую температуру стеклования, почти на 60 °C выше, чем у сахарозы той же молекулярной массы. Макромолекулы, такие как альбумин и гидроксиэтилкрахмал, могут быть добавлены в лиофилизированные составы для увеличения Т _г и стабильность при хранении ^26,27,28 . Вода действует как пластификатор и снижает температуру стеклования лиофилизированных образцов. Температура стеклования и, следовательно, стабильность при хранении зависят от остаточной влажности после лиофилизации ²⁹ .
Одной из проблем при использовании сахаров для сублимационной сушки клеток является загрузка клеток сахарами для внутриклеточной защиты ^{8, 30} . Недавно мы показали, что клетки действительно поглощают трегалозу при замораживании. Это происходит из-за дефектов мембраны, вызванных фазовыми переходами мембраны, вызванными замораживанием ^{31, 32} . В различных исследованиях мы показали, что индуцированное замораживанием поглощение трегалозы совпадает с хорошей крио-выживаемостью клеток ^{31, 33, 34} .
Целью данного исследования было изучение целостности биомолекулярных структур, в частности ДНК, в лиофилизированных фибробластах после загрузки клеток трегалозой во время замораживания. Клетки лиофилизировали в составах, состоящих из сахаров и альбумина, с известными различиями в температуре стеклования. Лиофилизированные составы сначала были охарактеризованы с точки зрения их стеклообразных свойств. Поведение мембранной липидной фазы и общую вторичную структуру белка изучали с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Повреждения ДНК в лиофилизированных клетках изучали при хранении при различных температурах с помощью «кометного анализа».
Результаты
Температуры стеклования и взаимодействие водородных связей сахарно-альбуминовых стекол
Температура стеклования является одним из наиболее важных параметров, определяющих стабильность лиофилизированных материалов при хранении. ИК-Фурье использовали для изучения температуры стеклования смесей трегалозы/альбумина, которые использовали для лиофилизации фибробластов. Для сравнения изучали смеси сахарозы и глюкозы с альбумином. Стекловидность сухих смесей сахара/альбумина анализировали с помощью инфракрасной спектроскопии. На рисунке 1 показано, как добавление альбумина влияет на температуру стеклования (T _г ). Значения T _g для чистой глюкозы, сахарозы, трегалозы и альбуминовых стекол были определены как 30 ± 1, 58 ± 1, 108 ± 3 и 180 ± 4 °C соответственно. Видно, что T _g увеличивается с увеличением содержания альбумина для всех испытанных сахаров. Смеси трегалоза/альбумин имеют самые высокие значения T _g . При содержании сахара 0,5 наблюдается точка перегиба в зависимости между Т _г и содержанием сахара как для сахарозы, так и для трегалозы. В смесях глюкоза/альбумин стеклования не наблюдалось при содержании глюкозы в смеси ниже 0,4, вероятно, из-за реакций между восстановлением глюкозы и альбумина (реакции потемнения) при нагревании.
Рисунок 1
Температура стеклования составов сахара/альбумина. Стекла были приготовлены путем сушки смесей альбумина и дисахаридов трегалозы (черные треугольники) и сахарозы (серые квадраты), а также моносахарида глюкозы (незаштрихованные кружки). Стекла имели содержание воды менее 0,05 г H ₂ O на г сухого веса ⁻¹ . Для получения температуры стеклования (T _g ) использовали FTIR. Показана зависимость Т _г от относительного массового содержания сахара для различных смесей сахар/альбумин. Средние значения ± стандартные отклонения были определены по крайней мере из трех независимых экспериментов.
Изображение в полный размер
Содержание воды и температуры стеклования в образцах лиофилизированных клеток
Содержание воды в образцах и значения T _г лиофилизированных фибробластов приведены в Таблице 1. Клетки, суспендированные в солевой среде (HSKM) без защитные агенты имели более высокое содержание остаточной влаги (0,12 ± 0,02 г H ₂ O г DW ⁻¹ ) по сравнению с образцами, высушенными вымораживанием с протравителями (0,06 ± 0,01 и 0,01 ± 0,00 g H _{2 г DW} ^-1 для трегалозы и трегалозы/альбумина соответственно). HSKM без защитных добавок образовывал однородную пористую структуру после сушки вымораживанием, однако при анализе ДСК стеклования не наблюдалось. Температуры стеклования были очевидны в образцах, лиофилизированных с трегалозой или трегалозой/альбумином, со значениями T _g 19 ± 6 °C и 97 ± 8 °C соответственно.
Таблица 1 Содержание влаги в образцах и значения T _г высушенных образцов, определенные непосредственно после лиофилизации.
Полный размер таблицы
Выживаемость клеток после замораживания и лиофилизации с трегалозой
Фибробласты криоконсервировали и лиофилизировали в среде HSKM без защитных средств, а также в среде с добавлением трегалозы, и анализировали жизнеспособность клеток. Добавление 250 мМ трегалозы перед замораживанием не влияло на процент клеток с неповрежденной мембраной (94 ± 4%). Образцы, криоконсервированные с трегалозой, показали 62 ± 20% неповрежденных клеток мембраны после оттаивания, тогда как в отсутствие трегалозы было восстановлено 37 ± 15% неповрежденных клеток мембраны, что свидетельствует о том, что трегалоза обладает криозащитными свойствами. Однако после лиофилизации клетки с целой мембраной не восстанавливались, независимо от добавления или отсутствия трегалозы (1 ± 1 и 0% соответственно).
Инфракрасные спектры фибробластов
Инфракрасная спектроскопия использовалась для оценки сохранности мембран и белков в лиофилизированных фибробластах. На рисунке 2 показаны спектры гидратированных, а также лиофилизированных фибробластов. Гидратированные образцы готовили в солевом растворе/D ₂ O, чтобы избежать интерференции полосы H ₂ O с полосой амида белка-I. Полосу растяжения OD можно увидеть около 2500 см ^-1 . Полосы валентных колебаний CH ₂, преимущественно возникающие из липидных ацильных цепей мембраны, видны в 2900–2800 см ⁻¹ обл. Полосы амида-I и -II, возникающие из эндогенных белков, видны при 1640 и 1560 см ^-1 соответственно. Область 1300–900 см ⁻¹ обозначена как область отпечатка пальца.
Рисунок 2
In situ инфракрасные спектры фибробластов; Показаны спектры ATR-FTIR лиофилизированных образцов без защитных средств (серая линия) и гидратированных образцов в солевом растворе/D ₂ O (черная линия). Полная область спектра (4000–900 см ^-1 ) с указанными полосами поглощения, обусловленными липидами эндогенной мембраны (CH ₂ — полосы растяжения, 3000–2800 см ^-1 ), белками (амид-I и -II полосы, 1700– 1500 см ^-1 ) и (ядерная) ДНК (PO ₄ — полосы растяжения, 1300–1000 см ^-1 ). Полоса растяжения OD, возникающая от D ₂ O, расположена между 2700–2200 см ⁻¹ .
Полноразмерное изображение
Фазовое поведение мембраны
Поведение мембранной фазы лиофилизированных фибробластов оценивали непосредственно после регидратации, а также через 1 день после регидратации. Фибробласты лиофилизировали без защитных средств, с трегалозой или с трегалозой/альбумином. Поведение мембранной фазы изучали, контролируя полосу CH ₂, возникающую от мембранных липидов, в зависимости от температуры образца. Первые производные были рассчитаны для более четкой визуализации мембранных фазовых переходов (рис. 3). Свежие контроли демонстрировали некооперативный широкий переход от 10 до 15 °C. После сушки вымораживанием наблюдалось множественное плавление липидов независимо от отсутствия или присутствия трегалозы и/или альбумина. Непосредственно после лиофилизации основной фазовый переход наблюдался при ~17 °С, тогда как через 1 день наблюдались дополнительные явления плавления липидов при ~6 и ~27 °С. Это может означать разделение фаз мембраны, вызванное накоплением продуктов перекисного окисления липидов, изменяющих поведение фаз липидов.
Рисунок 3
Поведение мембранной фазы свежих фибробластов (пунктирные линии, незакрашенные кружки), а также фибробластов, высушенных вымораживанием без защитных средств ( A ), с трегалозой ( B ) или трегалозой/альбумином (C ). Лиофилизированные образцы анализировали сразу после регидратации (серые линии, серые квадраты), а также через 1 день после регидратации (черные линии, темные квадраты). Спектры пропускания FTIR снимали при нагревании образца от 0 до 80 °C при 2 °C мин ^-1, определяли положение полосы валентных колебаний CH ₂ ( v CH ₂), возникающей из мембранных липидов, и наносили на график в зависимости от температуры образца (кружки и квадраты). Первые производные были определены для более четкой визуализации фазовых переходов (линии). Средние значения ± стандартные отклонения были определены из трех независимых экспериментов.
Изображение в полный размер
Общая вторичная структура белка
На рис. 4 показаны области полос амида-I (1700–1600 см ^-1 ) свежих и лиофилизированных фибробластов как до, так и после регидратации. Для сравнения представлены спектры термоденатурированных клеток. Профиль полосы амида-I регидратированных клеток очень похож на профиль свежих клеток. В высушенном состоянии профиль полосы амида-I отличается от профиля гидратированных и регидратированных клеток. Образцы, денатурированные нагреванием, демонстрируют отчетливые полосы при 1620 и 1684 см 90 248 -1 90 249, указывающие на протяженные структуры β-листов. Независимо от присутствия трегалозы в регидратированных клетках не наблюдалось признаков денатурации белка. Коэффициенты корреляции (значения r) были рассчитаны для количественной оценки различий в профиле полосы амида-I по сравнению со свежими клетками (рис. 4C). Было определено, что коэффициент корреляции клеток, денатурированных нагреванием, составляет 0,78, что указывает на структурные изменения в общей структуре белка при денатурации. Было определено, что в высушенном состоянии значения r составляют 0,89.и 0,86 для лиофилизированного образца с трегалозой и без нее соответственно. Однако после регидратации были обнаружены значения r 0,98 и 0,99 для образцов, высушенных вымораживанием с трегалозой и без нее, соответственно.
Рисунок 4
In situ Спектры ATR-FTIR фибробластов в области спектра 1700–1600 см ^-1, содержащие полосу амида-I, возникающую из эндогенных белков. Показаны нормированные исходные спектры ( A ), а также инвертированные спектры второй производной ( B ), чтобы более четко выявить различия. Коэффициент корреляции (r) рассчитывали для количественной оценки различий во вторичной структуре между свежими клетками и различными группами обработки ( C ). Показаны коэффициенты корреляции свежих (сплошные черные линии, белые столбцы) и высушенных фибробластов (сплошные серые линии, столбцы с ромбами); оба в солевом растворе (HSKM). Кроме того, показаны данные для регидратированных фибробластов после лиофилизации без защитных средств (штрихпунктирные серые линии, столбцы с диагональными линиями вниз) или с трегалозой (штрихпунктирные черные линии, столбцы с горизонтальными линиями). Для сравнения приведены данные термоденатурированных образцов (штриховые черные линии с диагоналями вверх).
Изображение полного размера
Стабильность ДНК лиофилизированных клеток при хранении
Целостность хроматина и повреждение ДНК фибробластов определяли до и после лиофилизации и хранения до 1 месяца при различных температурах с использованием «кометного анализа». Этот анализ включает окрашивание ДНК по Хёхсту после обработки лизисом и гель-электрофорез для разделения фрагментов ДНК в зависимости от их длины и степени повреждения. Репрезентативные микроскопические изображения показаны на рис. 5. Неповрежденная ядерная ДНК присутствует в «голове» кометы, тогда как фрагментированная ДНК выглядит как «хвост». Свежие фибробласты проявляют интенсивную флуоресценцию преимущественно в голове кометы и слабую флуоресценцию в хвостах. Повреждение ДНК при хранении проявляется в увеличении флуоресценции в хвосте кометы за счет флуоресценции в голове. Кроме того, длина хвоста кометы увеличивается после хранения при повышенных температурах и при сублимационной сушке без трегалозы.
Рисунок 5
Микрофотографии, полученные с помощью «кометного анализа» для оценки целостности хроматина и повреждения ДНК; для свежих фибробластов ( А ), а также фибробластов, подвергнутых лиофилизации с трегалозой ( В – Е ) или без защитных средств ( F ) и различных условиях хранения в высушенном состоянии. Лиофилизированные образцы регидратировали и анализировали сразу после лиофилизации ( B ), а также после 28-дневного хранения при 4 °C ( C ), 22 °C ( D ) и 37 °C ( E , F ). Клетки, помещенные в агарозу, подвергали лизису и щелочному электрофорезу, после чего окрашивали ДНК-интеркалирующим красителем Hoechst. Повышенное повреждение ДНК проявляется в виде более длинных «хвостов кометы» и повышенной интенсивности флуоресценции в «хвосте» за счет интенсивности «головы» или ядерной области.
Изображение в полный размер
«Кометы» были проанализированы для количественной оценки повреждений ДНК во время хранения. На рисунке 6 показаны длины хвостов комет и относительное содержание ДНК (интенсивность флуоресценции) в головах и хвостах. Было обнаружено, что после лиофилизации кометные хвосты увеличиваются для всех испытанных составов (55–71 против 34 ± 13 мкм для необработанных контролей). Длина кометного хвоста постепенно увеличивается при хранении при комнатной температуре, что указывает на потерю целостности ДНК. Лиофилизация с трегалозой привела к меньшему повреждению ДНК (т.е. более короткие хвосты 128 ± 31 мкм на 28 день) по сравнению с образцами, которые были лиофилизированы без защитных средств или с трегалозой/альбумином (146 ± 24 и 158 ± 41 мкм соответственно; р < 0,05). Различия были видны уже через 2 недели. Подтверждающие тенденции наблюдались в относительном содержании ДНК в голове/хвосте кометы. Относительное содержание ДНК в хвосте прогрессивно увеличивается при хранении при комнатной температуре. При хранении при 37 °C хвосты комет были значительно короче, если для лиофилизации использовалась трегалоза, тогда как добавление альбумина, по-видимому, не имело дополнительных защитных эффектов. При 4 °C длина хвоста кометы, а также содержание ДНК в голове после 4 недель хранения значительно отличались от таковых сразу после лиофилизации (рис. 6C и D).
Рисунок 6
Повреждение ДНК при хранении фибробластов в сухом виде оценивали с помощью «кометного анализа». Фибробласты лиофилизировали в солевом растворе без добавок (HSKM) или с трегалозой или трегалозой/альбумином. Хранение проводили в течение разного времени при комнатной температуре ( А , В ), а также при разных температурах в течение 1 месяца ( С , D ). Анализ проводили до лиофилизации (черные столбцы), сразу после лиофилизации (белые столбцы) и после 1–4 недель хранения при комнатной температуре (7 дней: столбцы с диагоналями вверх, 14 дней: столбцы с ромбами, 28 дней). : стержни с нисходящими диагоналями) ( А , В ). Кроме того, образцы были проанализированы после 28 дней хранения при 4°C и 37°C (без добавок: белые столбцы, с трегалозой: столбики с диагоналями вверх, с трегалозой/альбумином: столбики с диагоналями вниз) ( C , D ). По микроскопическим изображениям образцов, окрашенных по Хёхсту, были определены как длина хвоста кометы ( A , C ), так и относительное содержание ДНК (т.0054 Д ). Средние значения ± стандартные отклонения были определены из двух независимых экспериментов, и за одну обработку было проанализировано минимум 30 «комет».
Увеличить
Обсуждение
Хроматин в лиофилизированных соматических клетках не поврежден сразу после лиофилизации, но может повреждаться при хранении. Повреждение ДНК прогрессивно увеличивается с увеличением продолжительности хранения и температуры. Трегалоза снижает повреждение ДНК при хранении, тогда как добавление альбумина не оказывает дополнительного защитного действия на стабильность ДНК при хранении.
Для сухого консервирования биоматериалов вместо глюкозы ^{4, 20, 35} используются дисахариды, такие как сахароза и трегалоза, поскольку сахароза и трегалоза имеют более высокую температуру стеклования по сравнению с глюкозой ^{36, 37} и не имеют открытой образуют со свободной альдегидной группой, которая может реагировать с белками. Добавление альбумина увеличивает Т _г . Таким образом, добавление белка/полимера, подобного альбумину, к составам сахара для сухого сохранения клеток было предложено для улучшения стабильности при хранении ^{8, 38} . Однако мы не обнаружили положительного действия альбумина на сохранение хроматина в лиофилизированных фибробластах.
T _г образцов, высушенных вымораживанием с трегалозой и альбумином, явно выше, чем у образцов, высушенных вымораживанием только с трегалозой. Однако следует отметить, что T _g в основном отражает внеклеточный матрикс, а не внутриклеточный T _g . В ряде исследований мы показали, что трегалоза проникает в клетку во время индуцированных замораживанием фазовых переходов мембраны ^{31, 33, 34} . Напротив, гораздо более крупный альбумин, вероятно, не входит в клетку во время фазовых переходов, вызванных замораживанием. Таким образом, несмотря на то, что альбумин увеличивает T _g лиофилизированной композиции, внутриклеточная T _g не обязательно увеличивается при использовании альбумина. Это может объяснить тот факт, что альбумин не улучшает стабильность хранения клеточной ДНК в текущем исследовании. Альбумин по-прежнему полезен в качестве наполнителя в составе лиофилизированной сушки, поскольку он разделяет клетки в лиофилизированной матрице. Для тромбоцитов мы показали, что восстановление клеток увеличивается, когда для лиофилизации используется комбинация трегалозы и альбумина вместо одной трегалозы ⁸ . Одним из преимуществ использования альбумина является то, что лиофилизированный осадок имеет лучший внешний вид и более стабилен (т. е. не разрушается) и легче растворяется в воде по сравнению с использованием только трегалозы.
После лиофилизации клетки с целой мембраной не были восстановлены, независимо от использования защитных агентов. Также и для других типов клеток, как правило, клетки с неповрежденной мембраной не восстанавливаются после сушки вымораживанием ^{10, 16, 17} . Поведение мембранной фазы регидратированных клеток напоминает поведение свежих клеток. Однако в регидратированных клетках наблюдали множественные отчетливые пики плавления, которые становились более выраженными через 1 день после регидратации. Это, вероятно, отражает разделение фаз мембраны, вызванное накоплением продуктов перекисного окисления фосфолипидов (т.е. лизофосфолипидов). Последнее может быть результатом высокого уровня АФК, образующихся при замораживании и/или сушке ^{39, 40} . Сушка влияла на общую вторичную структуру белка. Однако после регидратации общая вторичная структура белка очень напоминала структуру свежих клеток.
Сохранение хроматина в соматических клетках представляет интерес для применений, когда ядерный материал лиофилизированных клеток переносится в другие клетки ⁴¹ или для амплификации специфических последовательностей. Здесь было обнаружено, что лиофилизация приводит к некоторой деградации ДНК, которая снижается в присутствии трегалозы. Повреждение ДНК постепенно увеличивалось при хранении при комнатной температуре. Трегалоза не может предотвратить повреждение ДНК при хранении при комнатной температуре, но повреждение меньше, чем при отсутствии трегалозы. Окисление, опосредованное свободными радикалами, считается основной причиной деградации ДНК во время хранения ^{42, 43} , независимо от наличия стеклообразного состояния ¹⁸ . АФК, которые накапливаются во время сушки вымораживанием, могут напрямую изменять структуру хроматина при регидратации. Кроме того, продукты перекисного окисления липидов могут повреждать ДНК ^{44, 45} . Стабильность ДНК в высушенных образцах определяется остаточной влажностью образца и наличием или отсутствием лиопротекторов ^{46, 47} . Остаточная вода ускоряет реакции разложения. Кроме того, известно, что такие факторы окружающей среды, как температура, относительная влажность и уровень кислорода, влияют на стабильность ДНК.0248 48 . Как правило, ДНК, упакованная в хроматин, более стабильна, чем голая ДНК, а очищенная ДНК более стабильна, чем ДНК в клетках или тканях, из-за присутствия окисляющих соединений ⁴⁸ . Было показано, что ненасыщенные липиды способствуют окислительному повреждению ДНК в лиофилизированных липоплексах при хранении ¹⁸ .
В заключение, несмотря на то, что после сушки вымораживанием и регидратации фибробластов не было извлечено жизнеспособных клеток, биомолекулярные структуры, по-видимому, в значительной степени не повреждены. Непосредственно после лиофилизации поведение мембранной фазы лиофилизированных клеток напоминает поведение свежих клеток, и лиофилизация не влияет на общую вторичную структуру белка. Хроматин остается неповрежденным после сушки вымораживанием, но может повреждаться при хранении. Показано, что повреждение ДНК прогрессивно увеличивается с увеличением продолжительности и температуры хранения и что трегалоза уменьшает повреждение ДНК во время хранения. Несмотря на то, что добавление альбумина увеличивало Т _г , по-видимому, не оказывает положительного влияния на стабильность хранения ДНК. Вероятно, это может быть связано с недостатком внутриклеточного альбумина, что означает, что внутриклеточный T _g не увеличивается в присутствии альбумина. Накопление повреждений ДНК в лиофилизированных клетках во время хранения можно предотвратить, если хранить образцы при температуре 4 °C или ниже.
Материалы и методы
Условия культивирования клеток
Клетки мышиных эмбриональных фибробластов (3T3) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% (об. /об.) эмбриональной бычьей сыворотки и 100 единиц мл ^-1 пенициллин/стрептомицин (Biochrom, Берлин, Германия). Культуры выращивали при 37 °C в присутствии 5% CO ₂ в колбах Т-75 (TPP Techno Plastic Products AG, Трасадинген, Швейцария). Каждые 2–3 дня клетки трипсинизировали путем инкубации с 0,05% (об./об.) трипсином в течение 3 мин при 37°С с последующим разбавлением в свежей DMEM. Затем клеточные суспензии центрифугировали (8 мин при 1000 × g), отсасывали супернатант и ресуспендировали осадок при 0,75 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 со свежим DMEM.
Криоконсервация и сушка вымораживанием
Осадок клеток разбавляли до 25–35 ×10 ⁶ клеток мл ⁻¹ в HEPES-буферном солевом растворе (HSKM; 10 мМ HEPES, 137 мг MCl мМ NaCl, 2. , pH 7,4), с последующим медленным добавлением равного объема HSKM с добавлением двукратной желаемой конечной концентрации защитных агентов; в результате 200 мкл 12,5–17,5 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 . Трегалоза (TRE; Пфанстиль, Цуг, Швейцария) и бычий сывороточный альбумин (БСА, молекулярная масса: 67000 г моль ^-1 ; Серва, Гейдельберг, Германия) использовались в качестве защитных средств. Трегалозу тестировали отдельно при конечной концентрации 250 мМ и в комбинации с равной массой альбумина (массовое соотношение 1/1; 9,5% вес/объем каждого). Образцы переносили во флаконы для лиофилизации (флаконы для инъекций Christ 2 R; Landgraf Laborsysteme, Лангенхаген, Германия) и замораживали в морозильной камере с регулируемой скоростью (CM-2000; Carburos Metalicos, Мадрид, Испания) при 40°C мин. ^–1. до −80 °C. Затем образцы погружали в жидкий азот и хранили при температуре -150°С не менее 24 ч в морозильной камере (MDF-1155ATN; Sanyo Electric Biomedical Co., Бад-Ненндорф, Германия). Для анализа после криоконсервации образцы размораживали в течение 5 мин на водяной бане при 37 °C и анализировали в течение 1 часа. Сушку вымораживанием проводили путем переноса замороженных образцов на полки лиофилизатора с регулируемой температурой (лиофилизатор Virtis Advantage Plus; SP Scientific, Уорминстер, США). Начальную температуру полки устанавливали на уровне –30 °С, после чего образцы охлаждали до –40 °С и выдерживали при этой температуре в течение 60 мин, снижая давление в камере до 60 мТорр. Первичную сушку проводили при температуре -30 °С в течение 400 мин. Вторичная сушка осуществлялась повышением температуры полки до 40 °С при 0,1 °С мин ^-1 , после чего температуру полки снова снижали до комнатной (20 °С). Регидратацию проводили путем добавления 200 мкл дистиллированной воды к высушенным образцам по каплям, а выживаемость определяли в течение 1 ч после регидратации.
Содержание воды (WC; в г H ₂ O на г сухого веса) лиофилизированных образцов определяли путем сравнения сырого веса (FW; в г, измеренного непосредственно после лиофилизации) и сухого веса (DW; в г, измерено после инкубации в течение ночи в печи при 80 °C).
Измерение жизнеспособности клеток
Концентрацию клеток и процент клеток с неповрежденной мембраной определяли с помощью окрашивания трипановым синим и с использованием гемоцитометра (Neubauer-Improved; Assistent, Sondheim v. d. Rhön, Germany) под световым микроскопом (Axiovert 40 C; Carl Zeiss, Геттинген, Германия). Образцы (200 мкл) разбавляли HSKM или HSKM с добавлением защитных агентов (800 мкл). Подсчитывали относительное количество клеток с неповрежденной/поврежденной мембраной (т.е. не окрашенных или проявляющих внутриклеточное окрашивание трипановым синим) и определяли концентрации клеток.
Измерения температуры стеклования (T
_g ) с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии
Измерения дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проводили с использованием прибора Netzsch DSC 204F1 Phoenix (Netzsch-Gerätebau GmbH, Selb, Germany). Непосредственно после лиофилизации 1–10 мг лиофилизированного образца переносили в алюминиевую кювету объемом 25 мкл, закрывали, взвешивали и помещали в прибор DSC. В качестве эталонного образца использовали пустую чашу. Для анализа стеклования образцы охлаждали до -20°С с последующим нагревом до 120°С, охлаждением до -20°С и нагревом до 150°С; при температуре 10 °C мин ⁻¹ . Первое сканирование использовали для получения однородного образца, а фактические температуры стеклования (значения T _g) определяли по второму сканированию при нагреве с использованием программного обеспечения Netzsch Proteus Analysis. За температуру начала стеклования принимали T _g.
Исследования с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье
Инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье (FTIR) Perkin-Elmer 100 (Perkin-Elmer, Норуолк, Коннектикут, США) использовали для регистрации инфракрасных спектров. Спектрометр был оборудован детектором триглицинсульфата (TGS) и устройством нарушенного полного отражения (НПВО) с кристаллом алмаз/ZnSe и прижимным рычагом. Был доступен держатель образца с регулируемой температурой для получения спектров пропускания. Он был подключен к нагревательному устройству (Harrick Scientific Products, Pleasantville, NY) и насосной системе Linkam, использующей жидкий азот в качестве хладагента (Linkam Scientific Instruments, Tadworth, Surrey, UK). Оптическая скамья непрерывно продувалась сухим воздухом из генератора продувочного газа FTIR (Whatman, Клифтон, Нью-Джерси, США). Параметры получения спектров: 4 см 9Разрешение 0248 −1 , 4 совместно добавленные интерферограммы, диапазон волновых чисел 4000–900 см ⁻¹.
Для изучения стеклообразного поведения лиофилизированных составов были приготовлены смеси глюкозы, сахарозы или трегалозы и альбумина при различных массовых соотношениях и конечной концентрации 20–50 мг мл ⁻¹ . Десять-двадцать мкл раствора сахар/альбумин переносили на окно CaF ₂ и высушивали в токе сухого воздуха (относительная влажность менее 3%) с образованием сахарных стекол. Остаточную воду удаляли путем нагревания образца до 100 °С в течение 3 мин, после чего образцы охлаждали до –30 °С с последующим нагревом до 180 °С при 1 °С мин ⁻¹ . Спектры собирали каждые 30–60 с. Положение полосы ОН-валентных колебаний при ~3300 см 90 248 -1 90 249 (νOH) контролировали в зависимости от температуры образца, чтобы следить за стеклообразным поведением, как описано ранее 90 248 28, 49 90 249 . Построив график зависимости νOH от температуры образца и добавив линии линейной регрессии как в жидком, так и в стеклообразном состоянии; Т _g определяли как точку пересечения этих двух линий регрессии.
Для изучения фазового поведения мембран свежих и регидратированных клеток использовали клеточные осадки объемом 10 мкл. Образцы охлаждали до 0 °С с последующим нагревом до 80 °С при 2 °С мин ^-1 , а спектры регистрировались каждые 30–60 с. Положение полосы симметричной полосы валентных колебаний CH ₂, возникающей из липидных ацильных цепей при ~ 2850 см ^-1 (νCH ₂ ), отслеживали в зависимости от температуры образца, как подробно описано в другом месте ⁵⁰ . Мембранные фазовые переходы определяли после получения первых производных графиков зависимости νCH ₂ от температуры с использованием 20-точечного коэффициента сглаживания.
Общая вторичная структура белка гидратированных и высушенных образцов клеток была изучена с помощью ATR-FTIR. Чтобы уменьшить вклад мешающих полос воды, гидратированные образцы (повторно) суспендировали в солевом растворе/D ₂ O. Солевой раствор/D ₂ O был получен добавлением D ₂ O к лиофилизированным образцам. Образцы клеток инкубировали в течение 1 часа в солевом растворе/D2O перед измерением. Спектральная область 1700–1600 см ^-1 была выбрана для анализа общей вторичной структуры белка в образцах. Были взяты вторые производные с использованием коэффициента сглаживания по 13 точкам, и спектры были нормализованы для более четкого разрешения различий в интенсивностях пиков. Для сравнения также анализировали денатурированные образцы, приготовленные путем инкубации в течение 10 мин при 80 °С. Для количественной оценки общего сходства между двумя спектрами второй производной был рассчитан коэффициент корреляции (r) с использованием следующего уравнения 9.{2}}}$$
, где x _i и y _i представляют собой значения спектральной оптической плотности эталонного спектра и спектра образца в частотной позиции i. Для идентичных спектров будет возвращено значение 1,0. Спектры с различиями будут показывать более низкие значения.
Гель-электрофорез отдельных клеток или «кометный анализ» для изучения повреждений ДНК
Образцы после лиофилизации тщательно закрывали пробками и помещали в вакуумные пакеты. Образцы хранили при 4, 22 или 37°С до 28 дней. После хранения в течение разного времени образцы переносили при -150 °C для последующей регидратации и одновременного анализа нескольких образцов. Для оценки целостности хроматина и повреждения ДНК использовали гель-электрофорез в одиночных клетках (SCGE). Этот анализ также известен как «кометный анализ» и подробно описан в другом месте 9.0248 52, 53 . Короче говоря, клетки заключали в агарозу на предметных стеклах микроскопа и подвергали электрофорезу в щелочных условиях для отделения фрагментов ДНК разного размера от ядра. Предметные стекла микроскопа сначала очищали (0,25 M HCl в 70% этаноле), покрывали 0,5% (вес/объем) агарозы и сушили в течение 24 часов при 37 °C. Слайды хранили при комнатной температуре до использования. Для SCGE клеточные суспензии (50 мкл ~20 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 ) разводили в 1% агарозе в солевом растворе при ~37 °C (800 мкл), получая 1 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 . Затем на пластину, установленную при 37°C, добавляли две капли по 14 мкл на предметное стекло, покрытое агарозой, которое было непосредственно закрыто покровным стеклом (10 ×10 мм). Предметные стекла переносили на предварительно охлажденную полку при 4 °C и инкубировали в течение 7 мин. После затвердевания агарозы покровные стекла осторожно удаляли. Дальнейшие процедуры проводили при приглушенном свете, растворы хранили при 4 °С. Образцы обрабатывали лизисным раствором (2,5 мМ NaCl, 0,1 мМ Na ₂ ЭДТА, 10 мМ ТРИС, 0,1% Тритон-Х100, 25 мМ ДТТ), в течение 30 мин при 4 °C. DTT добавляли в лизисный раствор непосредственно перед использованием. Предметные стекла хранили в горизонтальном положении, на каждое предметное стекло добавляли по 1 мл раствора. После инкубации раствор для лизиса удаляли, а образцы обрабатывали щелочным раствором (300 мМ NaOH, 1 мМ Na ₂ ЭДТА, pH > 13) в течение 30 мин при 4 °C. После этого проводили электрофорез в щелочном растворе при 4 °C в течение 20 мин при 20 В и 300 мА на установке для электрофореза Comet Plus (Biostep GmbH, Буркхардтсдорф, Германия) с источником питания (Biometra GmbH, Геттинген, Германия). . Были приняты меры, чтобы все слайды располагались в одной ориентации. После электрофореза сосуды для окрашивания использовали для промывания предметных стекол в дистиллированной воде и обезвоживания путем воздействия на них дозированной серией этанола (70, 9).0 и 100 v-%; 2 мин каждый). После этого образцы сушили на воздухе. После высушивания на агарозу с внедренными клетками добавляли 10 мкл 150 мкг мл окрашивающего раствора ^-1 Hoechst33342, накрывали покровным стеклом и образцы закрывали лаком для ногтей. Образцы наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (BX60; Olympus Corporation, Токио, Япония), оснащенного камерой «Colorview II» и прилагаемым программным обеспечением «Cell D» (Olympus Corporation). Микрофотографии были собраны с использованием увеличения 10 × 10 и времени экспозиции 2 с, и было проанализировано минимум 30 клеток/«комет» на обработку в каждом независимом эксперименте с использованием программного обеспечения «Komet» (Andor Technology Ltd, Белфаст, Великобритания). Для предварительных экспериментов был использован «CaspLab» для анализа комет ⁵⁴ .
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Sigmaplot (версия 13; Systat Software Inc., Сан-Хосе, Калифорния). Точки данных, представленные в этом исследовании, представляют собой средние значения из 3–4 независимых экспериментов, а планки погрешностей обозначают стандартное отклонение. Чтобы определить, были ли значимы различия между лечением/экспериментальными группами, был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.
Ссылки
«>
Пикал, М. Дж. Лиофильная сушка белков: процесс, рецептура и стабильность в Составление и доставка белков и пептидов , с. Химическое общество, 1994).
Карпентер, Дж. Ф., Аракава, Т. и Кроу, Дж. Х. Взаимодействие стабилизирующих добавок с белками во время замораживания-оттаивания и сушки вымораживанием. Дев. биол. Стоять. 74 , 225–238 (1992).
КАС пабмед Google ученый
Карпентер, Дж. Ф., Чанг, Б. С., Гарсон-Родригес, В. и Рэндольф, Т. В. Рациональный дизайн составов стабильного лиофилизированного белка: теория и практика. Фарм. Биотехнолог. 13 , 109–133 (2002).
КАС Статья пабмед Google ученый
Кроу, Л. М., Кроу, Дж. Х., Рудольф, А., Уомерсли, К. и Аппель, Л. Сохранение лиофилизированных липосом с помощью трегалозы. Арх. Биохим. Биофиз. 242 , 240–247 (1985).
КАС Статья пабмед Google ученый
Лесли С. Б., Израэли Э., Лайтхарт Б., Кроу Дж. Х. и Кроу Л. М. Трегалоза и сахароза защищают как мембраны, так и белки интактных бактерий во время сушки. заявл. Окружающая среда. микробиол. 61 , 3592–3597 (1995).
КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Абадиас, М. Х., Бенабарре, А., Тейсидо, Н., Усалл, Дж. и Виньяс, И. Влияние лиофильной сушки и защитных средств на жизнеспособность биоконтролирующих дрожжей Candida. Междунар. Дж. Пищевая микробиология. 65 , 173–182 (2001).
КАС Статья пабмед Google ученый
«>
Wakayama, T. & Yanagimachi, R. Развитие нормальных мышей из ооцитов, которым вводили лиофилизированные сперматозоиды. Нац. Биотехнолог. 16 , 639–641 (1998).
КАС Статья пабмед Google ученый
Wolkers, W. F., Walker, N. J., Tablin, F. & Crowe, J. H. Тромбоциты человека, содержащие трегалозу, выдерживают лиофилизацию. Криобиология 42 , 79–87 (2001).
КАС Статья пабмед Google ученый
Пьетрамаджори, Г., Кайпайнен, А., Чечуга, Дж. М., Вагнер, К. Т. и Оргилл, Д. П. Лиофилизированная богатая тромбоцитами плазма обладает полезными лечебными свойствами при хронических ранах. Регенерация раны. 14 , 573–580 (2006).
Артикул пабмед Google ученый
«>
Лои, П. и др. . Лиофилизированные соматические клетки направляют эмбриональное развитие после переноса ядра. PLoS Один 3 , e2978, doi:10.1371/journal.pone.0002978 (2008).
ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Биссойи, А. и др. . Последние достижения и будущие направления лиофилизации и высушивания мезенхимальных стволовых клеток. Стволовые клетки Int. 2016 , 1–9, doi:10.1155/2016/3604203 (2016).
Артикул Google ученый
Buchanan, S.S., Pyatt, D.W. & Carpenter, J.F. Сохранение дифференцировки и клоногенного потенциала человеческих гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников во время лиофилизации и хранения в условиях окружающей среды. PLoS Один 5 , e12518, doi:10. 1371/journal.pone.0012518 (2010).
ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Кроу Дж. Х., Карпентер Дж. Ф., Кроу Л. М. и Анкордогай Т. Дж. Являются ли замораживание и обезвоживание похожими переносчиками стресса? Сравнение режимов взаимодействия стабилизирующих растворов с биомолекулами. Криобиология 27 , 219–231 (1990).
КАС Статья Google ученый
Чанг Б.С., Бове Р.М., Донг А. и Карпентер Дж.Ф. Физические факторы, влияющие на стабильность при хранении лиофилизированного антагониста рецептора интерлейкина-1: стеклование и конформация белка. Арх. Биохим. Биофиз. 331 , 249–58 (1996).
КАС Статья пабмед Google ученый
«>
Нейлд, Д. М., Брауэрс, Дж. Ф., Коленбрандер, Б., Агуэро, А. и Гаделла, Б. М. Образование перекиси липидов в связи со стабильностью мембран свежих и замороженных размороженных сперматозоидов жеребца. мол. Воспр. Дев. 72 , 230–238 (2005).
КАС Статья пабмед Google ученый
Оно, Т., Мизутани, Э., Ли, К. и Вакаяма, Т. Перенос ядер сохраняет ядерный геном лиофилизированных клеток мыши. Дж. Репрод. Дев. 54 , 486–491 (2008).
КАС Статья пабмед Google ученый
Das, Z. C., Gupta, M. K., Uhm, S. J. & Lee, H. T. Лиофилизированные соматические клетки направляют эмбриональное развитие после интрацитоплазматической инъекции цельных клеток в ооциты свиньи. Криобиология 61 , 220–224 (2010).
Артикул пабмед Google ученый
Molina, M.C. и др. . Стабильность лиофилизированных комплексов липид/ДНК при длительном хранении. Дж. Фарм. науч. 93 , 2259–2273 (2004).
КАС Статья пабмед Google ученый
Olaciregui, M. & Gil, L. Лиофилизированные сперматозоиды: инструмент будущего? Репрод. Дом. Аним. 52 (Приложение 2), 248–254 (2017).
КАС Статья пабмед Google ученый
Кроу, Л. М., Рейд, Д. С. и Кроу, Дж. Х. Является ли трегалоза специальным средством для сохранения сухих биоматериалов? Биофиз. Дж. 71 , 2087–2093 (1996).
ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
«>
Сан, В. К., Леопольд, А. С., Кроу, Л. М. и Кроу, Дж. Х. Стабильность сухих липосом в сахарных стаканах. Биофиз. Дж. 70 , 1769–1776 (1996).
ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Кроу, Дж. Х., Хекстра, Ф. А. и Кроу, Л. М. Ангидробиоз. лет. Преподобный Физиол. 54 , 579–599 (1992).
КАС Статья пабмед Google ученый
Костер, К. Л. Стеклообразование и устойчивость семян к высыханию. Завод Физиол. 96 , 302–304 (1991).
ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Buitink, J. & Leprince, O. Стеклообразование в растительных ангидробиотах: выживание в сухом состоянии. Криобиология 48 , 215–228 (2004).
КАС Статья пабмед Google ученый
Wyatt, T.T., Wosten, A.B. & Dijksterhuis, J. Споры грибов для рассеивания в пространстве и времени. Доп. заявл. микробиол. 85 , 43–91 (2013).
Артикул пабмед Google ученый
Шиньяшики Н. и др. . Стеклование в водных растворах белка (бычий сывороточный альбумин). J. Phys. хим. Б 113 , 14448–14456 (2009 г.).
КАС Статья пабмед Google ученый
Кроу Дж. Х., Оливер А. Э., Хекстра Ф. А. и Кроу Л. М. Стабилизация сухих мембран смесями гидроксиэтилкрахмала и глюкозы: роль витрификации. Криобиология 35 , 20–30 (1997).
КАС Статья пабмед Google ученый
Сыдыков Б., Олденхоф Х., Симе Х. и Волкерс В. Ф. Взаимодействие водородных связей и энтальпийная релаксация в сахарно-белковых стеклах. Дж. Фарм. науч. 106 , 761–769 (2017).
КАС Статья пабмед Google ученый
Роос Ю. и Карел М. Влияние воды и молекулярной массы на стеклование аморфных углеводов и растворов углеводов. Дж. Пищевая наука. 56 , 1676–1681 (1991).
КАС Статья Google ученый
Сатпати, Г. Р. и др. . Загрузка эритроцитов трегалозой: шаг к биостабилизации. Криобиология 49 , 123–136 (2004).
КАС Статья пабмед Google ученый
«>
Чжан, М., Олденхоф, Х., Симе, Х. и Волкерс, В.Ф. Вызванное замораживанием поглощение трегалозы клетками млекопитающих облегчает криоконсервацию. Биохим. Биофиз. Акта 1858 , 14:00–14:09 (2016).
КАС Статья пабмед Google ученый
Чжан, М., Олденхоф, Х., Симе, Х. и Волкерс, В.Ф. Комбинирование эндоцитарного и индуцированного замораживанием поглощения трегалозы для криоконсервации клеток млекопитающих. Биотехнолог. прог. 33 , 229–235 (2017).
КАС Статья пабмед Google ученый
Stoll, C., Holovati, J.L., Acker, J.P. & Wolkers, W.F. Синергетические эффекты липосом, трегалозы и гидроксиэтилкрахмала для криоконсервации эритроцитов человека. Биотехнология. прог. 28 , 364–371 (2012).
КАС Статья пабмед Google ученый
Глафке, К., Акхунди, М., Олденхоф, Х., Симе, Х. и Волкерс, В.Ф. Криоконсервация тромбоцитов с использованием трегалозы: роль поведения мембранной фазы во время замораживания. Биотехнология. прог. 28 , 1347–1354 (2012).
Артикул пабмед Google ученый
Кроу, Дж. Х. и др. . Стабилизация сухих клеток млекопитающих: уроки природы. Интегр. Комп. биол. 45 , 810–820 (2005).
КАС Статья пабмед Google ученый
Симперлер, А. и др. . Температура стеклования глюкозы, сахарозы и трегалозы: экспериментальное исследование и исследование in silico. J. Phys. хим. Б 110 , 19678–19684 (2006 г. ).
КАС Статья пабмед Google ученый
Волкерс, В. Ф., Оливер, А. Э., Таблин, Ф. и Кроу, Дж. Х. Исследование сахарных стекол с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Углевод. Рез. 339 , 1077–1085 (2004).
КАС Статья пабмед Google ученый
млн лет, X. и др. . Небольшой стрессовый белок действует синергетически с трегалозой, придавая клеткам млекопитающих толерантность к высыханию. Криобиология 51 , 15–28 (2005).
ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google ученый
Молина, М. Д. и Анчордокви, Т. Дж. Деградация лиофилизированных комплексов липидов/ДНК во время хранения: роль липидов и активных форм кислорода. Биохим. Биофиз. Акта 1778 , 2119–2126 (2008 г.).
КАС Статья пабмед Google ученый
Аяла, А., Муньос, М. Ф. и Аргуэльес, С. Перекисное окисление липидов: производство, метаболизм и сигнальные механизмы малонового диальдегида и 4-гидрокси-2-ноненаля. Оксид. Мед. Сотовый Лонгев. 2014 , 360438, doi:10.1155/2014/360438 (2014).
Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Квон И. К., Пак К. Э. и Нива К. Активация, формирование и развитие пронуклеуса in vitro ооцитов свиньи после интрацитоплазматической инъекции лиофилизированных сперматозоидов. биол. Воспр. 71 , 1430–1436 (2004).
КАС Статья пабмед Google ученый
«>
Имлей, Дж. А. и Линн, С. Повреждение ДНК и токсичность кислородных радикалов. Наука 240 , 1302–1309 (1988).
ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед Google ученый
Lloyd, D. R. & Phillips, D. H. Окислительное повреждение ДНК, опосредованное реакциями Фентона с медью (II), железом (II) и никелем (II): доказательства сайт-специфических механизмов образования двухцепочечных разрывов, 8- гидроксидезоксигуанозин и предполагаемые внутрицепочечные поперечные связи. Мутат. Рез. 424 , 23–36 (1999).
КАС Статья пабмед Google ученый
Inouye, S. Сайт-специфическое расщепление двухцепочечной ДНК гидропероксидом линолевой кислоты. ФЕБС Летт. 172 , 231–234 (1984).
КАС Статья пабмед Google ученый
«>
Уэда К., Кобаяши С., Морита Дж. и Комано Т. Сайт-специфические повреждения ДНК, вызванные продуктами перекисного окисления липидов. Биохим. Биофиз. Акта 824 , 341–348 (1985).
КАС Статья пабмед Google ученый
Шарма В.К., Клибанов А.М. Влагоиндуцированная агрегация лиофилизированной ДНК и ее предотвращение. Фарм. Рез. 24 , 168–175 (2007).
КАС Статья пабмед Google ученый
Боннет, Дж. и др. . Цепная и конформационная стабильность твердотельной ДНК: значение для хранения при комнатной температуре. Рез. нуклеиновых кислот. 38 , 1531–1546 (2010).
КАС Статья пабмед Google ученый
«>
Anchordoquy, T.J. & Molina, M.C. Сохранение ДНК. Консервант для клеток. Технол. 5 , 180–188 (2008).
Артикул Google ученый
Волкерс, В. Ф., Олденхоф, Х., Альберда, М. и Хекстра, Ф. А. Исследование сахарных стекол с помощью инфракрасной микроспектроскопии с преобразованием Фурье: применение к ангидробиотическим клеткам высших растений. Биохим. Биофиз. Акта 1379 , 83–96 (1998).
КАС Статья пабмед Google ученый
Wolkers, W. F. & Oldenhof, H. Использование in situ Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье для изучения замораживания и сушки клеток в . Протоколы криоконсервации и лиофилизации, 3-е издание, Methods in Molecular Biology 1257 (eds Wolkers) , WF & Oldenhof, H.) 147–161 (Springer, 2015).
Престрелски С. Дж., Тедески Н., Аракава Т. и Карпентер Дж. Ф. Конформационные переходы в белках, индуцированные дегидратацией, и их ингибирование стабилизаторами. Биофиз. Дж. 65 , 661–671 (1993).
ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Тайс, Р. Р. и др. . Одноклеточный гель/кометный анализ: рекомендации для in vitro и in vivo генетические токсикологические испытания. Окружающая среда. Мол. Мутаген. 35 , 206–221 (2000).
КАС Статья пабмед Google ученый
Нандхакумар, С. и др. . Оценка повреждения ДНК с помощью одноклеточного гель-электрофореза (кометный анализ). Дж. Фармакол. Фармацевт. 2 , 107–111 (2011).
КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый
Коньца А. и др. . Кросс-платформенная общедоступная программа анализа изображений для ПК для анализа комет. Мутат. Рез. 34 , 15–20 (2003).
Google ученый
Скачать ссылки
Благодарности
Эта работа финансировалась Немецким исследовательским фондом (DFG: Deutsche Forschungsgemeinschaft) через Кластер передового опыта «От регенеративной биологии к реконструктивной терапии» (REBIRTH) и гранта WO1735/6-1, SI1462/4-1, а также соответствующее финансирование DAAD (STIBET III).Публикация этой статьи финансировалась Фондом открытого доступа Университета Лейбница в Ганновере.
Author information
Authors and Affiliations
Institute of Multiphase Processes, Leibniz Universität Hannover, Hannover, Germany
Miao Zhang, Bulat Sydykov & Willem F. Wolkers
Unit for Reproductive Medicine, University of Veterinary Medicine Ганновер, Ганновер, Германия
Харриетт Олденхоф, Джудит Бигалк и Харальд Симе
Авторы
Мяо Чжан
Посмотреть публикации авторов
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Harriëtte Oldenhof
Просмотреть публикации автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Булат Сыдыков
Просмотр публикаций автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Джудит Бигалк
Посмотреть публикации автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Harald Sieme
Просмотр публикаций автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Willem F. Wolkers
Просмотр публикаций автора
Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar
Contributions
М.З. провел большую часть измерений и анализа данных и написал рукопись с помощью Х.О. Б.С. провел исследования стеклования, представленные на рисунке 1. Дж. Б. помог с анализом комет, представленным на рисунках 5 и 6. и Х.С. помогали в планировании экспериментов и обсуждении результатов. В.В. участвовал в надзоре и руководстве проектом, а также в редактировании рукописи.
Автор, ответственный за переписку
Переписка с Виллем Ф. Уолкерс.
Декларации этики
Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Дополнительная информация
Примечание издателя: Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональной принадлежности.
Права и разрешения
Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставьте ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
Перепечатка и разрешения
Об этой статье
Эту статью цитирует
Индуцированные сушкой и температурой конформационные изменения нуклеиновых кислот и хроматина спермы жеребца в составах для консервирования трегалозы
Раффаэле Бронья
Juezhu Fan
Харриетт Олденхоф
Научные отчеты (2021)
Приложения, проблемы и потребности в использовании синтетической биологии за пределами лаборатории
Сьерра М. Брукс
Хэл С. Альпер
Nature Communications (2021)
Криоконсервация NK- и Т-клеток без ДМСО для адоптивной клеточной иммунотерапии
Сюэ Яо
Сандро Матошевич
Биопрепараты (2021)
Высокая выживаемость спермы баранов после частичной сушки вымораживанием после оттаивания
Амир Арав
Антонелла Идда
Серхио Ледда
Журнал вспомогательной репродукции и генетики (2018)
Биотехнологическое производство трегалозы по пути трегалозосинтазы: текущее состояние и перспективы на будущее
Сюэ Цай
Инес Сейтл
Бо Цзян
Прикладная микробиология и биотехнология (2018)
Комментарии
Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Правила сообщества. Если вы обнаружите что-то оскорбительное или не соответствующее нашим условиям или правилам, отметьте это как неприемлемое.
Восстановить профиль ВКонтакте. Как восстановить пароль к странице вк после удаления
Окна. Видеокарты. Винчестеры. Интернет. Мониторы. Процессоры » Источники питания » Восстановить профиль ВКонтакте. Как восстановить пароль к странице ВК после удаления
ВК не дает восстановить доступ через СМС. Есть привязанный номер, но ВК отправляет код на почту или, если почта не привязана, сразу требует восстановить по заявлению с документом и фото.
Почему мне недоступно быстрое восстановление пароля?
У вас включена защита входа (SMS-подтверждение входа). Вы забыли пароль и пытаетесь восстановить доступ, но получаете сообщение об ошибке:
Быстрое восстановление пароля недоступно. Для вашей страницы включено подтверждение входа с мобильного телефона.
Или так:
К сожалению, вы не можете сбросить пароль, используя указанный номер телефона.
Или другой вариант:
Ошибка. Эта функция недоступна для этой страницы.
Это значит, что некоторое время назад вы сами включили подтверждение входа по мобильному телефону, когда для входа на страницу нужно вводить не только пароль, но и код, отправленный на телефон:
Когда стоит охрана входа ( двухфакторная аутентификация), это повышает безопасность и защищает от взлома, но вы забыли пароль. Что делать? Получить код восстановления на телефон уже невозможно, т.к. подтверждение входа — это когда вы знаете пароль и имеете доступ к телефону. И то, и другое вместе. Только так можно обеспечить безопасность, которую вы сами добровольно включили. Больше невозможно восстановить страницу только с одним телефоном, если вы не знаете пароль. Сайт ВК вас обо всем предупреждал, но вы не читали, когда включали защиту. Может быть, поэтому вы чувствуете, что вас не предупредили.
Ниже мы рассмотрим все варианты восстановления доступа в данной ситуации.
Внимание! Вот абсолютно все способы, которые есть у вас в 2020 году. Бесполезно искать что-то еще или спрашивать в комментариях. Только вы можете восстановить доступ. Прочитай до конца и сделай как написано. Синие ссылки ведут на другие страницы, которые вам помогут.
Как теперь восстановить пароль доступа к странице?
1. Восстановление по электронной почте
Если у вас подключено дополнительное подтверждение входа, то вместо быстрого восстановления пароля по СМС используется восстановление пароля по электронной почте (e-mail). Ваша страница связана с электронной почтой? Если это так, вы можете запросить ссылку для сброса пароля. (Инструкции откроются в новом окне). Может оказаться, что страница привязана к почте, но вы не можете войти в почту (нет доступа или просто не помните) — в этом случае лучше сначала попробовать восстановить доступ к почте , иначе вам останется единственный путь, он сложнее и требует гораздо больше времени — восстановление через службу поддержки.
2. Восстановить через поддержку
Когда включено подтверждение входа, но вы забыли пароль и страница НЕ привязана к почте (или нет доступа к почте, или вы не помните адрес), единственный способ восстановить страницу — запрос в техподдержку. По этой ссылке откроется форма восстановления доступа, которую необходимо заполнить. Лучше это делать с компьютера, а не с телефона. Подробную инструкцию смотрите здесь:
Если не работает, сделайте через полную версию на компе.
Вам нужно будет доказать, что страница принадлежит вам. Если там нет ваших реальных фотографий или не указаны ваши настоящие имя и фамилия, то восстановить страницу практически невозможно (или очень сложно). Ведь вас обо всем предупредили, когда вы включали охрану входа. Вы можете увидеть, почему приложение может быть отклонено. Конечно, можно обратиться в поддержку ВК и попытаться каким-то образом доказать, что страница ваша. Если они увидят, что вы нормальный человек и что страница действительно ваша, то могут идти дальше. Если и после этого ничего не произойдет, зарегистрируйте новую страницу в ВК. Это урок на будущее.
Почему я не могу восстановить пароль через SMS, если включено подтверждение входа?
Потому что вы сами включили ДВУХФАКТОРНУЮ (ДВУХЭТАПНУЮ) аутентификацию, и теперь хотите сбросить пароль, имея только ОДИН фактор (телефон). Но это не так. Представьте: если бы кто-то имел доступ к вашей сим-карте, он бы украл вашу страницу, даже не зная пароля. Это больше не будет двухфакторной аутентификацией. Я должен был прочитать предупреждение, когда решил включить эту функцию. Все способы сброса пароля в данной ситуации мы описали выше, их всего два.
У меня есть резервные коды, почему я не могу с их помощью восстановить пароль?
Потому что резервные коды, которые вы выписали или распечатали, нужны, когда нет доступа. на телефон — то есть когда вы не можете получить СМС для входа. А у вас нет пароля, вы его забыли. В этом случае резервный код не поможет.
Нет больше восстановления?
Другого способа восстановить доступ нет. Искать их бесполезно. То есть другого способа его восстановить вообще нет. Вы просто прочитали все возможные способы. если вы не понимаете.
У меня не включено подтверждение входа, но ВК все равно требует восстановить по запросу
Можно ли отключить подтверждение входа?
Да, конечно можете. Но для этого нужно знать пароль и зайти на страницу, а затем в настройки безопасности. А если вы пока не можете этого сделать, то и подтверждение входа вы не можете отключить. Даже наличие доступа к странице не поможет, если вы не помните пароль. Восстановите доступ, как описано выше.
Довольно часто я вижу, как люди удаляют свои страницы ВКонтакте и от полноценной страницы человека остается только дохлая собака с отражением его жизни за несколько лет. Если это страницы друзей, мне и грустно, и радостно за человека одновременно. С одной стороны, он вроде бы вырвался из-под влияния социальной сети и окунулся в реальную жизнь, с другой стороны, теперь с ним будет сложнее общаться.
Но проходит время и в 95% случаев удаленная страница появляется снова. Человек просто восстанавливает удаленную страницу ВКонтакте и продолжает пользоваться ею как ни в чем не бывало.
Как это происходит? Дело в том, что любую удаленную личную страницу ВКонтакте можно восстановить в течение определенного времени. Таким образом, соцсеть позволяет пользователям остыть и вернуть свой профиль, а не создавать его заново, снова добавляя информацию, друзей и фотографии.
В течение какого времени можно восстановить страницу
По поводу времени, через которое можно восстановить удаленную страницу ВКонтакте, в интернете опубликовано много противоречивой информации, поэтому я сделал запрос в техподдержку соц. сети, чтобы развеять ваши сомнения.
Официальный ответ: Аккаунт будет удален безвозвратно только через 210 дней, до этого вы сможете восстановить его в том виде, в котором вы поставили его на удаление.
Об этом же написано в часто задаваемых вопросах.
Итак, удаленную страницу ВКонтакте можно восстановить за Семь месяцев , а если быть точным, то за 210 дней . По истечении этого времени ни обращение в техподдержку, ни какие-либо другие действия уже не помогут.
Как восстановить страницу
До истечения 210 дней с момента удаления страницы она по сути просто скрыта от других пользователей, вы в любой момент можете зайти ВКонтакте и восстановить ее.
Срок полного удаления страницы запоминать не обязательно, так как вы всегда можете авторизоваться и просмотреть ее.
Если не получается войти
Бывает, что вы удалили свою страницу ВКонтакте, а на номер мобильного телефона другой страницы уже зарегистрирован. В этом случае вы не сможете войти в аккаунт удаленной страницы и восстановить его. Но выход очень прост. Привяжите новую страницу к другому номеру телефона. Теперь по старому номеру телефона, после авторизации вы будете переходить на свою удаленную страницу.
Как восстановить страницу в ВК зависит от причины заморозки или удаления профиля. Если действие было временным, а доступ к аккаунту сохранен, проблем не будет. А вот восстановление после длительного удаления или без логина и пароля потребует гораздо больше усилий или вообще будет невозможно.
На срок, отведенный на восстановление аккаунта, влияют особенности блокировки или удаления. Сценариев развития событий может быть 3.
Аккаунт заблокирован по жалобам. Прежде чем восстановить удаленную страницу в ВК, вам придется отбыть наказание. Нарушения типа спама в первый раз отправят пользователя в бан на сутки, во второй — на 2-14, в третий — на пару недель или месяц. В тяжелых случаях — вымогательство, распространение материалов для взрослых или пропаганда насилия — может быть заблокировано сразу и навсегда без возможности восстановления.
Учетная запись была заморожена из-за подозрительной активности. Это происходит, когда система видит несвойственную пользователю активность и ограничивает доступ к аккаунту в целях защиты от взлома. Вернуть такую страницу «к жизни» можно сразу — введите свой номер телефона для получения кода и смены пароля.
Учетная запись удалена пользователем. Если вы избавились от страницы самостоятельно, вы можете восстановить ее в любой момент. Но только тогда, когда с момента последнего удаления прошло не более 7 месяцев. По истечении этого времени профиль будет потерян навсегда.
Как восстановить страницу ВКонтакте после удаления
Перед тем, как восстановить страницу ВКонтакте после ручного удаления, посмотрите срок хранения учетных данных. Дата безвозвратной потери аккаунта указана на главной странице — авторизуйтесь и смотрите. Также должна быть ссылка «Восстановить». Нажмите ее, подтвердите действие — и страница быстро вернется в прежний вид.
Как вернуть аккаунт если нет доступа к телефону
Авторизованным пользователям не нужен номер телефона для восстановления после удаления вручную. Запрос обрабатывается моментально, без дополнительных данных. А вот людям, потерявшим доступ к соцсети из-за смены номера, придется подождать. Работа службы поддержки с аналогичной проблемой занимает до трех дней.
Помните, как восстановить страницу в ВК без номера телефона:

При переходе сайт предложит сменить пароль — нужно придумать ранее не использовавшийся. Далее можно переходить к процедуре возврата профиля после ручного удаления, ссылку можно найти в настройках.
Как восстановить страницу ВКонтакте, если забыл логин и пароль
Если нет возможности вернуть доступ через почту, под полем логин из третьего пункта найдите ссылку «Нажмите здесь». На открывшейся странице укажите путь к профилю, а затем предоставьте доказательства того, что вы являетесь его владельцем. Для этого пригодится информация о недавней активности, фото и паспорт.
Завершите действие, нажав «Применить». В течение 2-3 агентов поддержки рассмотрят заявку и вынесут вердикт: вернуть доступ, запросить дополнительные доказательства или отказать.
Восстановление заблокированной страницы
Вы можете вернуть заблокированную страницу двумя способами.
Если забанен по жалобе. Зайти в «контакт» с компьютера, прочитать причину наказания и срок. Дождитесь окончания блокировки. После этого социальная сеть предложит восстановить страницу ВК по номеру телефона. Запросите код подтверждения, введите, измените пароль и пользуйтесь сервисом дальше.
Заблокирован из-за странной активности. Если доступ к профилю ограничен за распространение однотипных сообщений или записей из нетипичного места, штрафа не будет. Пользователи имеют право немедленно начать процесс восстановления — нажмите соответствующую кнопку и следуйте инструкциям.
Как восстановить страницу ВК без фото и паспорта
Вернуть анкету без загруженных личных фото и документов, подтверждающих родство с владельцем, практически невозможно. Есть только один способ, и мало шансов: написать в поддержку и доказать, что аккаунт принадлежал вам.
Как восстановить страницу при взломе
При взломе профиля действия могут быть идентичными вышеперечисленным и немного отличаться. Выбор плана зависит от того, удалось ли злоумышленникам сменить пароль, номер и связанную почту. Если хакерам не удалось сделать ничего из этого, войдите в систему и нажмите на ссылку для запроса восстановления данных на странице блокировки. Введите стандартный номер, подтвердите выбор страницы и введите шифр, отправленный на привязанный номер.
Если злоумышленники сменили телефон, действуйте следующим образом:

Если вы использовали фальшивые имя и фамилию в профиле, после восстановления информация может быть изменена принудительно в соответствии с паспортом. Результаты обработки запроса в течении пары дней придут на указанный контактный телефон.
Как восстановить старую страницу ВК
Работа со старой страницей будет идентична, только доказать причастность к ее созданию будет сложнее. Хорошо, если в профиле останутся личные фото, а имя и фамилия будут соответствовать указанным в документах. В этом случае достаточно восстановить страницу ВКонтакте по имени и фамилии — приложить к обращению в поддержку скан паспорта и картинку на фоне страницы.
Если невозможно идентифицировать вас как владельца по данным, указанным в аккаунте, вы не сможете вернуть аккаунт. Как и в случае, когда с момента ручного удаления прошло более 7 месяцев. Считай записи потерянными навсегда.
Как восстановить страницу в ВК через телефон
Официальное приложение ВК для мобильных позволяет выполнять некоторые из перечисленных операций с телефона. Но даже если вы используете сторонний клиент или устаревшую версию, вернуть профиль без компьютера реально. Для этого:
открыть приложение;
под полями авторизации тапнуть на «Забыли пароль» или аналогичную ссылку;
дождаться загрузки страницы внутри клиента или в полной версии сайта в браузере;
введите соответствующий адрес электронной почты или номер;
запросите код подтверждения и введите для доступа к личной информации;
смените пароль и запустите восстановление удаленной учетной записи, если вы пытались избавиться от нее вручную.

Часто в социальной сети ВКонтакте возникают ситуации, когда пользователи теряют доступ к своему профилю. Чаще всего это происходит из-за взлома. Или если вы забыли имя пользователя и пароль. В этих случаях вы можете восстановить страницу разными способами – в зависимости от причины ее потери.
Deleted Page
Возврат доступа к самостоятельно удаленному профилю — самый простой способ его восстановления. Сделать можно в течение 7 месяцев после удаления , иначе возможность реанимировать аккаунт будет полностью потеряна. Все очень просто:
Нужно перейти по ссылке vk.com. Сайт покажет, что страница удалена. Чтобы вернуть его, достаточно нажать кнопку «Восстановить свою страницу».
Если данные правила не были нарушены, значит страница была взломана мошенниками. Для возврата профиля вам потребуется:
Выполнить авторизацию в ВК ( vk.com ) под тем же логином и паролем. На странице появится уведомление о временной блокировке.
Для восстановления аккаунта введите в специальное поле номер мобильного телефона, который использовался при регистрации.
Вам придет СМС с кодом подтверждения — его нужно записать в форму.
Для безопасности профиля необходимо создать новый пароль.
Если вышеперечисленные действия не помогли, придется обращаться в службу поддержки ВК.
Важно: Восстановить доступ к странице раньше срока, указанного в уведомлении о блокировке, не получится. Разморозка аккаунта всегда бесплатна, а предложения ускорить процесс за деньги являются мошенничеством.
Если вы забыли логин или пароль
Бывают ситуации, когда логин или пароль заменены хакером или случайно забыты. А вот в восстановлении данных нет ничего сложного:
Для начала рекомендуется попробовать авторизоваться по ссылке — vk.com.
Если при вводе данных для доступа к странице они окажутся неверными, необходимо нажать на кнопку «Забыли пароль или не можете войти?».
Далее необходимо ввести номер телефона или адрес электронной почты, которые были использованы при регистрации. Им будет отправлен код авторизации. Затем нужно придумать новый пароль. Если пользователь не помнит эти данные, нужно перейти по ссылке чуть ниже.
Форма содержит адрес страницы. Если он неизвестен пользователю, можно найти себя через поиск людей.
После этого в поля заявки нужно ввести все данные, которые помнит владелец страницы — доступный номер телефона, старый номер, старую электронную почту и пароль. Затем нужно нажать кнопку «Подать заявку». Если предоставленной информации достаточно для восстановления, на указанный номер будет отправлен код авторизации.
Важно: в сложных случаях восстановления аккаунта служба поддержки ВК может запросить паспортные данные и фото, сделанное на фоне компьютера с открытой страницей.
Подведение итогов
Иногда восстановить страницу в социальной сети не так просто, как вернуть ее после самостоятельного удаления или . Во избежание подобных ситуаций необходимо использовать сложные пароли для авторизации и иметь доступ к номеру телефона, на который был зарегистрирован профиль.
По ряду причин определенному количеству пользователей необходимо удалить свою страницу в меге. Кто-то прощается со своей страницей навсегда. Но есть и те, для кого возвращение в ВК — лишь вопрос времени. Вы можете восстановить ранее удаленную страницу, но есть некоторые ограничения, о которых пойдет речь в статье.
Обычно, если вы сами удалили страницу, сервис ВКонтакте дает вам целых семь месяцев. Это период, в течение которого у вас есть возможность без проблем восстановить свою старую добрую страницу. Это абсолютно бесплатно.
П.С. И вообще, запомните раз и навсегда, если ВКонтакте просит у вас деньги за что-то, будь то вход в ваш профиль или его восстановление, это самый настоящий обман! Не вижу этого.

Восстановление происходит быстро, и более того, вы можете восстановить страницу и всех своих друзей и контакты, группы и даже записи в ленте, которые вы когда-либо добавляли.
Начнем. Для того, чтобы восстановить собственную страницу после удаления, вам необходимо зайти на сайт ВКонтакте — vk.com. В графе вам понадобятся: пароль, номер телефона, E-mail или логин.
Если вы ввели данные правильно, то обязательно увидите страницу, на которой будет написано, что страница удалена, но, несмотря на это, ее можно восстановить на такую-то дату. Стоит выбрать этот пункт. На следующей странице нам нужно будет подтвердить свои намерения, стоит нажать на кнопку «Восстановить страницу» . На этом операция завершилась успешно. Следующая страница, которую вы увидите, будет содержать тот раздел новостей ВКонтакте, к которому вы привыкли.
Что делать, если ваша страница заблокирована администрацией сайта, это не вирус и не подходит пароль это может быть номер мобильного телефона, адрес электронной почты или логин.
На следующем шаге вам будет предложено ввести вашу фамилию, которая ранее была указана на вашей странице.

alexxlab
[email protected]
Добавить комментарий Отменить ответ
Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *
Комментарий *
Имя *
Email *
Сайт

Рубрики:
Andorid/ IOS Приложения
Авторизация VK
Вход
Дизайн
Мобильная версия
Моя страница
Музыка
Музыка VK
Приложение
Приложения
Разное
Страница
Темы для VK
Related Posts

Разное
Почему грудничок плачет по вечерам: основные причины и способы успокоить малыша

Разное
Кал у грудничка после банана: особенности стула и почему он может меняться

Разное
Лечение насморка у детей по методу Комаровского: эффективные способы и рекомендации
Copyright © 2013- 2025 Socialvk.ru
Закрыть
Menu